Citotossicità. effetto di un agente chimico, fisico o biologico in grado di indurre danno ad una cellula. Teramo,

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1 Citotossicità effetto di un agente chimico, fisico o biologico in grado di indurre danno ad una cellula

2 Limite degli studi in vitro In un sistema in vitro è difficile definire gli effetti sistemici e fisiologici di una sostanza; per questo molti test sono mirati a studiare gli effetti a livello cellulare citotossicità Effetto tossico in vitro Apprezzabile a livello cellulare Modificazioni nel metabolismo cellulare Cambiamenti nella vitalità Alterazione della proliferazione vs Effetto tossico in vivo Valutabile a livello sistemico Reazioni infiammatorie Danni epatici Effetti vascolari

3 Limite degli studi in vitro Gli effetti riscontrati in un sistema in vitro dovranno poi essere interpretati come la risposta che lo stesso tipo di cellule utilizzate avrebbero avuto in vivo Modelli in vitro Vantaggi Pratici, economici, riproducibili Permettono di individuare e studiare i meccanismi molecolari Valutazione tempo/dose dipendenza Non utilizzano animali vs Limiti Azione sistemica non valutabile Effetti indesiderati non valutabili Non tiene conto delle interazioni ambientali Un buon modello in vitro deve essere costruito attentamente: es. colture d organo, condizioni adeguate, presenza di ormoni, ecc..

4 Test di citotossicità Parametri valutati Morfologia Attività proliferativa Vitalità/ Integrità di membrana Attività metabolica Analisi genetica Metodi utilizzati Osservazione al microscopio Conta cellulare, Doubling time, Test di proliferazione (BrdU) Coloranti penetranti la membrana (propidium iodide, trypan blue) MTT, Mitotracker Cariotipo, Sister Chromatid Exchange (SCE), analisi molecolari

5 Osservazione della morfologia cellulare CTR Distribuzione nella piastra di coltura Confluenza/inibizione da contatto 2.5uM CHIR Presenza di vacuoli Interazioni cellula-cellula 5uM CHIR Membrane plasmatiche, contorni irregolari

6 Trattato CTR Attività proliferativa Conta cellulare Doubling time BrdU + / FITC BrdU PI + BrdU BrdU + / FITC PI + BrdU Camera di Neubauer n cell/ml Valuta la velocità di replicazione mediante la costruzione di una curva di crescita Le cellule vengono coltivate in presenza di BrdU (analogo delle basi), che viene incorporata al posto della timidina durante la fase di replicazione. Solo le cellule in attiva proliferazione conterranno la BrdU e saranno positive (FITC)

7 Vitalità / Integrità di membrana Propidium iodide (PI) Calcein AM Calcein-AM (vive) Propidium Iodide (morte) Merge Il PI attraversa le membrane danneggiate e colora solo le cellule morte. Al microscopio a fluorescenza si colorano in rosso. E un colorante vitale, che attraversa le membrane delle cellule vive; una volta entrato le esterasi intracellulari scindono gruppo acetossimetil (AM), diventa fluorescente ed impermeabile alla membrana. Le cellule vive sono verdi, quelle morte sono rosse.

8 Attività metabolica Saggio dell MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) MitoTracker on epitelial cells MitoTracker MitoTracker on kidney cells E un saggio colorimetrico che sfrutta la capacità delle deidrogenasi mitocondriali di scindere l anello tetrazolico della molecola di MTT (sale di tetrazolio) di colore giallo per dare un sale di formazano violetto. La quantità di formazano prodotta viene misurata allo spettrofotometro; è proporzionale al numero di cellule vive. Le cellule trattate con la sostanza da analizzare vengono incubate con la soluzione contenente l MTT. Dopo circa tre ore (tempo necessario affinché si formi il sale di formazano), viene misurata l assorbanza a 490 nm. I dati così ottenuti vengono normalizzati rispetto al controllo ed utilizzati per costruire le curve dose-risposta. Il MitoTracker è un colorante mitocondriale fluorescente che entra nella cellula per diffusione passiva. Nei mitocondri funzionali è ossidato a catione fluorescente. La colorazione è molto semplice perché è sufficiente incubare le cellule con MitoTraker probes che si accumulerà nei mitocondri funzionali. La caduta del potenziale di membrana mitocondriale è uno degli eventi precoci della cascata apoptotica.

9 Analisi genetica Sister Chromatid Exchange (SCE) SCE sono scambi reciproci di segmenti di DNA fra cromatidi fratelli, durante fase S del ciclo cellulare. L'incubazione con BrdU per due cicli cellulari consecutivi permette l identificazione di scambi, dopo colorazione con coloranti fluorescenti per il DNA (Hoechst, Acridine Orange). BrdU S1 In fluorescenza si evidenziano mediante colorazione differente dei due cromatidi, poiché la BrdU smorza la fluorescenza del colorante: i filamenti bisostituiti saranno più deboli di quelli monosostituiti. S2 SCEs Senza BrdU Con BrdU