CRESCITA BATTERICA. Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.

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1 Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. CRESCITA BATTERICA CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica» CdS Medicina e Chirurgia Università G. d Annunzio, Chieti-Pescara AA

2 CRESCITA BATTERICA FISSIONE BINARIA

3 CRESCITA BATTERICA DIVISIONE CELLULARE Rhodophyta spp. (alga rossa) Durante la divisione, l aumento dei costituenti cellulari può tradursi in: aumento delle dimensioni cellulari microrganismi cenocitici: divisioni nucleari non accompagnate da divisioni cellulari (es. alghe, muffe) aumento del numero cellulare batteri, lieviti, protozoi Rhizopus spp (Zigomicete, muffa) La Microbiologia generalmente studia la crescita di una popolazione, piuttosto che la crescita delle singole cellule Moraxella catharralis

4 CINETICA DELLA DIVISIONE CELLULARE LA CURVA DI CRESCITA Classicamente, la curva di crescita è la rappresentazione della cinetica di crescita di microrganismi coltivati in terreno liquido (brodo) Misura la variazione della quantità (concentrazione) di batteri nel tempo: rappresentazione grafica di tipo semilogaritmica Log 10 della concentrazione cellulare (espressa come CFU/ml, dove CFU= unità formanti colonie) vs tempo Si articola in 4 fasi (periodi), distinte e sequenziali

5 FASE DI LATENZA (LAG PHASE) Fase di adattamento metabolico: sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico Durata variabile (specie-specifica): in alcuni casi può essere di breve durata od assente

6 FASE ESPONENZIALE (LOG PHASE) Chiamata anche fase logaritmica Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva (max velocità) gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata) Velocità di crescita costante nel tempo: aumento del numero cellulare aumento della massa cellulare totale

7 FASE STAZIONARIA Numero totale di cellule vitali rimane costante: arresto della riproduzione: la velocità riproduttiva è controbilanciata dal tasso di mortalità (numero cellulare costante) metabolismo quasi quiescente (cryptic growth) espressione di specifici geni di sopravvivenza Possibili cause: raggiungimento di una densità critica di popolazione accumulo dei cataboliti (azione tossica) limitazione dei nutrienti limitata disponibilità di O 2

8 FASE DI MORTE (DECLINO) Morte cellulare a velocità esponenziale Morte dovuta a: perdita irreversibile della capacità di riprodursi lisi cellulare In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta per la presenza di cellule resistenti (Viable But Not Culturable, VBNC)

9 VIABLE BUT NOT-CULTURABLE CELLS (VBNC) Molte specie batteriche patogene per l uomo* entrano nello stato VBNC a seguito di starvation e basse temperature: una strategia di adattamento a condizioni ambientali sub-ottimali per la crescita. Sorgenti di VBNC: acqua (corrente, dolci, salate), terreno, cibo Le VNBC di batteri patogeni perdono la loro virulenza, salvo poi a riacquistarla quando le condizioni ambientali ottimali si ristabiliscono: alterata verifica di qualità nella industria alimentare, nei sistemi di distribuzione idrica o nei campioni clinici riattivazione di una infezione a seguito di un periodo di latenza Le VNBC sono elementi metabolicamente quiescenti: si ritrovano nel biofilm e sono resistenti agli antibiotici. * Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Burkholderia cepacia, etc.

10 CRESCITA BATTERICA MODELLIZZAZIONE MATEMATICA N t = N 0 x 2 n N t = N o x 2 t logn t = logn o + t dove: N t = n. cellule al tempo t N o = n. cellule al tempo 0 n = n. generazioni al tempo t = n. generazioni nell unità di tempo (h) t = tempo trascorso (h)

11 CRESCITA BATTERICA ESPONENZIALE

12 TEMPO MEDIO DI GENERAZIONE Tempo di generazione medio dipendente dalla specie. Tuttavia, la gran parte dei batteri ha un tempo di generazione che oscilla tra 20 e 60 minuti, in condizioni ottimali (in vitro, ossia in laboratorio). Di contro, il tempo di generazione osservato nell ospite (in vivo, al sito di infezione) è maggiore, oscillando tra le 5 e 10 h.

13 CRESCITA BATTERICA DIAMO I NUMERI Nel caso di una coltura batterica contenente 10 cellule di Escherichia coli (N 0 =10), dopo 12 h di incubazione (t=12) avranno luogo 36 generazioni (n=36; considerando un tempo di generazione medio di 20 min), ossia la popolazione batterica sarebbe composta da un numero N t di cellule pari a: N t = N 0 x 2 n 12 h N 12h = 10 x 2 36 = cellule dopo 48 h di incubazione, il peso della popolazione risultante sarebbe volte maggiore di quello della Terra!!! (peso singola cellula: ~ 9.5 x g) Fortunatamente ciò non accade! La crescita viene infatti limitata dalla mancanza di nutrienti essenziali e/o dalla produzione di cataboliti tossici. La popolazione entra nella fase stazionaria.

14 LOG PHASE (FASE ESPONENZIALE) CRESCITA BILANCIATA Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata: i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera congiunta Di contro, si osserva crescita non bilanciata in presenza di: modificazione del livello dei nutrienti - shift-up (terreno "povero terreno ricco ) - shift-down (terreno ricco terreno povero ) modificazioni delle condizioni ambientali

15 COLTURE CONTINUE CHEMOSTATO Coltura vecchia (in fase stazionaria) Coltura giovane (in fase logaritmica) Necessità di un modello che riproduca fedelmente la situazione in vivo. Chemostato, consente il controllo indipendente di velocità di crescita e densità cellulare: velocità del terreno in ingresso = velocità del terreno in uscita nutriente essenziale in quantità limitanti incremento costante del numero cellulare e della massa batterica

16 COLTURA SINCRONIZZATA VS NON SINCRONIZZATA Escherichia coli (t gen = 20 min) Coltura non sincronizzata: ogni cellula si riproduce a tempi LEGGERMENTE DIFFERENTI. La curva ha andamento lineare. Coltura sincronizzata: ogni cellula si riproduce allo STESSO tempo. La curva ha andamento a scala (altezza di un gradino è 2x quella del gradino precedente)

17 DIMENSIONE DI POPOLAZIONE CELLULARE TECNICHE DI MISURAZIONE Conta vitale cellular ( gold standard ) Metodo della semina su terreno agarizzato Metodo di filtrazione su membrana Conta diretta cellulare (non fornisce indicazioni sulla vitalità cellulare) Conteggio in camera contaglobuli Contatori elettronici Altre tecniche Misurazione della assorbanza (densità ottica) Misurazione della massa cellulare

18 CONTA VITALE CELLULARE TECNICA SU TERRENO AGARIZZATO I batteri crescono alla superficie di un terreno agarizzato formando colonie Ciascuna colonia è formata da milioni di cellule batteriche, progenie derivante dalla iniziale cellula madre (popolazione clonale) E pertanto possibile esprimere la dimensione di popolazione come numero di unità formanti colonie (UFC; oppure CFU: colony-forming units)

19 CONTA VITALE CELLULARE TECNICA SU TERRENO AGARIZZATO Determinazione delle dimensioni di una popolazione batterica formatasi in un terreno liquido (brodo) Diluizioni seriali (10-fold) del campione Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione Incubazione (37 C, 24h) Conteggio del numero di colonie (UFC) Calcolo n cellule nella popolazione

20 CONTA VITALE CELLULARE METODO DELLE MEMBRANE FILTRANTI Particolarmente adatto per l analisi dei campioni ambientali (acque fluviali e marine)

21 CONTA DIRETTA CELLULARE CONTEGGIO MEDIANTE CONTAGLOBULI Semplice, economico e veloce Adatto per la conta di eucarioti e procarioti Limitazioni: NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare scarsa precisione e sensibilità ( 10 6 cells/ml) disponibilità di un microscopio ottico

22 CONTA DIRETTA CELLULARE CONTATORI ELETTRONICI Passaggio forzato della sospensione microbica attraverso un orifizio di piccole dimensioni Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all orifizio Conteggio degli eventi (n di cellule) grazie alla interruzione della corrente elettrica Veloce e di semplice esecuzione Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche Tuttavia: NON distingue le cellule vive dalle morte

23 ALTRE TECNICHE MISURAZIONE TURBIDIMETRICA (ASSORBANZA) La densità ottica è la quantità di luce in grado di passare attraverso una sospensione batterica. Principio: tanto maggiore sarà il numero cellulare, tanto più densa (torbida) sarà la coltura. Questo significa che, in presenza di crescita batterica, una quantità minore di luce sarà in grado di passare attraverso il campione, a causa della torbidità della sospensione cellulare.

24 ALTRE TECNICHE MISURAZIONE DELLA MASSA CELLULARE Peso secco tempi lunghi scarsamente sensibile Quantità di un particolare costituente cellulare proteina, DNA o ATP adeguato se la quantità del target è costante in ogni cellula Misurazione turbidimetrica (light scattering) comune impiego veloce, semplice e sensibile

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