UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1. Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging.
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1 UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1 Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging Lezione 5: Generalità à sul sistema immunitario: Introduzione alla radioimmunologia D. Cecchin, F. Bui Sistema immunitario? Il sistema immune è costituito da quell insieme di molecole e cellule deputate alla risposta alla introduzione di sostanze estranee all organismo (sia di natura infettiva che non infettiva). Primi esempi storici: Gli antichi cinesi avevano intuito il problema e facevano inalare ai bambini le croste dei sopravvissuti al vaiolo. Cio in qualche modo forniva una vaccinazione. Jenner E. ed altri più tardi, nel 1798, impiegharono per la prima volta il termine vaccinazione (da vaccus=mucca).
2 Immunità Naturale Vs Acquisita Immunità naturale o aspecifica: Nasce con l individuo e non viene modificata dal contatto con gli agenti estranei (ne fanno parte le barriere fisiche, gli eosinofili e molte altre cellule e molecole). Si divide in risposta umorale e cellulo mediata. Immunità acquisita o specifica: Stimolata ed amplificata dalla esposizione a sostanze estranee. Ne fanno parte i linfociti e gli anticorpi che guidano anche parte della risposta aspecifica Più lenta rispetto alla aspecifica Si divide in risposta umorale e cellulo mediata Immunità Specifica: Umorale/Cell Med Immunità umorale: mediata da molecole circolanti come gli anticorpi che riconoscono ed aiutano ad eliminare gli antigeni. Immunità cellulo mediata: mediata da cellule, i linfociti. I teorici della immnunità cellulare (linfociti) ed umorale (anticorpi) si sono scontrati per decenni fino alla moderna teoria integrata: l immunità umorale e cellulo-mediata sono coordinate dalla azione di diversi tipi di linfociti: LINFOCITI B: Si differenziano in cellule che producono anticorpi (più attiva verso agenti extracellulari come microbi extracellulari e tossine) LINFOCITI T: Guidano la risposta cellulo mediata (più attiva verso agenti intracellulari dove la risposta umorale stenta ad arrivare).
3 Immunità Specifica: Attiva/Passiva Immunità attiva: Quando l individuo si trova esposto ad un agente estraneo, reagisce, e si forma le proprie difese partendo dai linfociti B e T. Dopo l infezione permangono delle cellule particolari dette di memoria che ricordano l infezione in caso di nuovo contagio. Immunità passiva: Vengono trasferite cellule o siero di un soggetto che ha reagito in uno che non è stato esposto. Il secondo soggetto diviene immune (si pensi come esempio al veleno dei serpenti). Caratteristiche della risposta immune 1 1) Specificità: La risposta immune è specifica per i diversi determinanti antigenici o epitopi (parti degli antigeni). I linfociti B e T esprimono recettori specifici di membrana che riconoscono tali epitopi. 2) Diversità: Il repertorio linfocitario ovvero il numero dei possibili riconoscimenti antigenici è stato stimato, nei mammiferi, in circa ) Memoria: L esposizione ad un antigene aumenta (non crea!) la capacita di rispondere a quell antigene. Le risposte immunitarie secondarie (quelle cioè successive alla prima) sono più rapide ed efficaci.
4 Caratteristiche della risposta immune 2 4) Auto limitazione: Tutte le risposte immuni si esauriscono da sole (o quasi si pensi alle malattie autoimmuni) una volta risolto il pericolo 5) Discriminazione del self dal non-self: la risposta distingue antigeni estranei ed antigeni propri. In altri termini il sistema è tollerante verso i propri antigeni ma non verso antigeni estranei (non self). Ciò è alla base dei problemi che esistono nei trapianti d!organo nei quali un organo è estraneo all!individuo (per esempio un rene). Ecco perche! un individuo trapiantato, per tutta la vita, deve assumere dei farmaci che vengono detti immunosoppressori che servono a controllare la risposta immune del ricevente. Purtroppo come è intuibile la soppressione della risposta immune comporta non pochi rischi per il ricevente (infettivi, neoplastici, reumatologici ecc) Fasi della risposta immune 1) Riconoscimento: Si ha il legame fra antigeni e recettori presenti sui linfociti. I linfociti B riconoscono principalmente antigeni in fase fluida, i linfociti T sequenze peptidiche sulla superfice delle cellule. 2) Attivazione: Proliferazione dei linfociti specifici che si diffeenziano: i linfociti B si differenziano in cellule che producono anticorpi, i linfociti T in cellule che attivano i fagociti ed in T di risposta (chiamati T-helper) 3) Fase effetrice: E! data sia dai linfociti attivati che dalle cellule mobilizzate dai linfociti T-helper e dagli anticorpi (che attivano il complemento che partecipa alla lisi degli agenti estranei. Il complemento e! costituito da una serie di proteine in grado, se attivate, di creare dei canali nella parete cellulare e di aiutare, essere complementari alla risposta cellulare)
5 Anticorpi: Generalità Esistono molti diversi tipi di anticorpi ognuno derivante da uno specifico ceppo o clone di linfociti B, e ciascuno dotato di una struttura specifica. Tali anticorpi, tutti diversi, si trovano mescolati ad una miriade di altre molecole proteiche (e risultavano perciò, nel passato, difficili da studiare!) Quando si scoprì che un particolare tumore detto mieloma multiplo produce un gran numero di molecole anticorpali tutte uguali si ebbe finalmente il modo di purificarle, cristallizzarle ed in definitiva studiarle. Distribuzione degli anticorpi: si ritrovano, oltre che nel plasma, anche sulla superficie di molte cellule del sistema immune e nei fluidi di secrezione (muco, latte ecc). Se si coagula il sangue gli anticorpi restano in una fase fluida detta siero. Se nel siero ci sono un gran numero di anticorpi tutti contro uno specifico antigene quel siero viene solitamente definito antisiero. Struttura degli anticorpi Tutti gli anticorpi hanno caratteristiche simili che spiegano alcune comuni caratteristiche fisico-chimiche quali carica elettrica e solubilità. Tutti sono costituiti da: a) Due catene pesanti (55-70 Kd) b) Due catene leggere (24 Kd) Ad ogni catena pesante è unita una catena leggera. Le due catene pesanti sono unite fra loro da ponti disolfuro. Tutte le proteine di questo tipo si ripiegano in un comune motivo globulare (dominio immunoglobulinico) il che ha fatto pensare che derivino da un gene comune. Si parla perciò di superfamiglia delle immunoglobuline.
6 Struttura degli anticorpi Si possono dividere le porzioni aminoterminali (N) di un anticorpo in zone: 1)Ipervariabili: In questa zona si forma una tasca costituita da parte della catena pesante e parte della catena leggera. La regione è molto variabile ed è deputata al riconoscimento dei diversi epitopi antigenici. Tali regioni che determinano la complementarietà fra anticorpo ed antigene sono dette CDR (complementarity determining regions). 2)Variabili: è una zona di minore variabilità caratterizzata da cambiamenti minori 3)Costanti. La radioimmunologia Il dosaggio radioimmunologico si basa: 1) sulla specificità della interazione anticorpale. 2) sulla sensibilità della rivelazione radiochimica. In altre parole per dosare sostanze presenti nel sangue in concentrazioni piccolissime, tra microgrammo ed il picogrammo (10-6 -> ), si deve usare la combinazione tra una tecnica molto sensibile (la radiochimica, in grado di rilevare, se presenti, tracce piccolissime di attivita!) ed una molto specifica (l!immulologia, la reazione anticorpale che riesce a distinguere una specifica proteina in mezzo a migliaia di altre proteine, vitamine, enzimi, farmaci ecc.) Due componenti: 1) Ligando (ciò che voglio misurare ) 2) Legante o recettore
7 Classificazione dei dosaggi di legame Possiamo dividere i moderni dosaggi di legame in: 1) Dosaggi per valutare il legante o recettore. 2) Dosaggi per valutare il ligando. Bisogna considerare attentamente in questi dosaggi: 1) il tipo di legante (anticorpo, proteine circolanti, recettori) 2) il tipo di tracciante (isotopo, enzima, fago, particelle fluorescenti) 3) tipo di separazione Nel caso della medicina nucleare in vitro il ligando è la sostanza ignota da dosare, il legante o recettore una sostanza con specificità per il ligando (spesso si tratta di anticorpi) ed il tracciante un isotopo radioattivo (in genere tecnezio o iodio). Capitoli della immunometria 1) Dosaggi radioimmunometrici (RIA/IRMA): Si utilizzano anticorpi marcati (come nell!irma) oppure antigeni marcati (come nel RIA) per quantificare una molecola di interesse. Pur essendo l!irma piu! semplice e talora più sensibile del RIA spesso non sono disponibili gli anticorpi specifici marcati per attuare la tecnica. 2) Metodi fluoroimmulologici: Oggi molte delle tecniche di medicina nucleare in vitro sono in competizione con i dosaggi fluoroimmunologici che si basano sullo stesso principio citato ma, al posto del tracciante radioattivo utilizzano un tracciante fluorescente (fluoresceina, terre rare, ecc). Tecniche analoghe sono quelle di chemioluminescenza che sfruttano il luminolo. Ciò ha il notevole vantaggio che non si utilizzano sostanze radioattive. Purtroppo però l!immunofluorimetria non ha raggiunto la specificità possibile con i composti radioimmunologici (perche! i composti si legano anche altrove). Per tale motivo, specie quando si debbano dosare sostanze presenti in concentrazioni piccolissime il gold standard restano le tecniche di medicina nucleare in vitro.
8 Capitoli della immunometria 3) Tecniche immunoenzimatiche (es: EIA): In questo caso spesso non servono fasi di separazione: sono tecniche omogenee (fase liquida) che utilizzano enzimi. Se invece servono alcuni passaggi per separare i componenti (fase liquida+solida) si parla di tecniche eterogenee: L!ELISA (enzime linked immuno sorbent assay) è una di queste. E` un sistema a sandwich (anticorpo+ antigene da dosare vengono legati da un anticorpo coniugato con un enzima). Un tipico schema di ELISA e! il seguente: (Ab+Ag DA DOSARE ) (Ab+Ag DA DOSARE ) + (Ab ENZIMA ) (Ab+Ag DA DOSARE ) + (Ab ENZIMA ) + substrato dell!enzima Dosaggi competitivi e non competitivi I dosaggi di legame si dividono inoltre in: 1) Dosaggi competitivi (come il RIA) dove c!e competizione fra antigene freddo ed antigene marcato per un certo numero (limitato) di siti anticorpali. Il recettore o legante è un anticorpo specifico contro il ligando da misurare. Si parla perciò di dosaggi in difetto di reattivo (di anticorpo). 2) Dosaggi non competitivi (come l!irma) dove il tracciante non e! l!antigene radioattivo ma l!anticorpo radioattivo presente in eccesso. Si parla perciò di dosaggi in eccesso di reattivo. Sia nei dosaggi non competitivi che in quelli competitivi il legante e! l!anticorpo ma il tracciante nei competitivi e! l!antigene marcato, nei non competitivi e! l!anticorpo marcato.
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