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1 Universita degli Studi di Bologna FACOLT A DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea in Fisica MODELLI FISICO-MATEMATICI PER LA MEMORIA IMMUNOLOGICA E L'IMMUNOSENESCENZA Tesi di Laurea di: Fabio Luciani Relatore: Chiar.mo Prof. Giorgio Turchetti Corelatori: Chiar.mo Prof. Claudio Franceschi Dott.ssa Silvana Valensin Sessione 1 AA 1999/2

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3 Universita degli Studi di Bologna FACOLT A DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI Corso di Laurea in Fisica MODELLI FISICO-MATEMATICI PER LA MEMORIA IMMUNOLOGICA E L'IMMUNOSENESCENZA Tesi di Laurea di: Fabio Luciani Relatore: Chiar.mo Prof. Giorgio Turchetti Corelatori: Chiar.mo Prof. Claudio Franceschi Dott.ssa Silvana Valensin Parole chiave: processi stocastici, dinamica non lineare, sistemi complessi, memoria immunologica, immunosenescenza Sessione 1 AA

4 2 Modelli per l'immunologia INDICE Introduzione : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 4 1 Il Sistema Immunitario umano : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Caratteristiche generali dell Sistema Immunitario : : : : : : : : : : : : : : : : : : Immunita innata ed immunita specica : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Il ciclo della risposta immunitaria : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : La memoria immunologica : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Origine delle cellule memoria : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Modelli teorici per le cellule T di memoria : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : L'immunosenescenza : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Caratteristiche generali dell'invecchiamento : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Cambiamento del repertorio cellulare : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Teoria dello stress : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Prospettiva evolutiva del sistema immunitario : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 36 2 Un modello stocastico per la dinamica di popolazione dei linfociti T e loro ruolo nella sopravvivenza umana : : : : : : : : : : : Introduzione : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Dinamica di popolazione in immunologia : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Caratteristiche generali del modello sulla dinamica dei linfociti T : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Sviluppo del modello per i marcatori CD45 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Fit dei dati sperimentali : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : I marcatori CD95: una verica della loro adabilita : : : : : : : : : : : : : : : : Soglie di sopravvivenza : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Risultati e conclusioni del modello DP : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 64 3 Un modello per l'espansione clonale dei linfociti T: Approccio deterministico : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Modellizzazione dell'espansione clonale : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Modello per un singolo clone soggetto a carico antigenico esterno : : : : Singolo clone in assenza di potenziale : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Modello per un singolo clone in regime di over damping : : : : : : : : : : : : :77

5 Indice Modello per un singolo clone in regime di damping debole : : : : : : : : : : : 84 4 Un modello per l'espansione clonale dei linfociti T: Approccio stocastico : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Crossreattivita e rumore di fondo : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :9 4.2 Il modello stocastico : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Risposta clonale a stimolazioni aspeciche croniche : : : : : : : : : : : : : : : : : Risposta clonale a stimolazioni speciche e cross-reattive : : : : : : : : : : : Conclusioni del modello EC : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 17 APPENDICE A: Soluzione della Fokker-Planck per il processo di Ornstein Ulembeck : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 18 APPENDICE B: Calcolo della condizione di salto della barriera : : : : : 111 Conclusioni : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 115 Ringraziamenti : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 116 bibliograa : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 117

6 4 Modelli per l'immunologia Introduzione L' oggetto di questa tesi consiste in un approccio teorico allo studio della memoria immunologica e dell'immunosenescenza attraverso una modellizzazione fenomenologica su scale temporali paragonabili a quella della vita umana. L'approccio sico matematico alle problematiche immunologiche e stato costruito considerando il Sistema Immunitario (SI) come un sistema complesso caratterizzato, nella sua globalita, da fenomeni biologici che evolvono su piu scale spazio temporali. In particolare, sono state analizzate soprattutto le scale spaziali intermedie (mesoscopiche) dove avviene il passaggio dai fenomeni tipicamente molecolari a quelli macroscopici come la dinamica del sistema circolatorio, del sistema endocrino e di quello linfatico. Questa scala intermedia, nella trattazione del SI, e stata resa possibile dall'introduzione nel modello dei processi stocastici come un mezzo matematico per tentare di mettere in relazione la dinamica microscopica molecolare con quella dei fenomeni macroscopici. Le nuove teorie recentemente esposte dal Prof. Franceschi e dai suoi collaboratori, nelle quali si propone una visione globale del SI durante la fase dell'invecchiamento, hanno fornito un utile riferimento per una descrizione corretta del SI da un punto di vista sia biologico sia sico (2;25;29). Sulla base di queste teorie unicanti si esporranno due modelli sico{matematici per dare una descrizione fenomenologica di alcuni meccanismi biologici su una scala temporale dell'ordine della vita umana. Si mettera in evidenza il ruolo dell'interazione stocastica del SI umano con l'ambiente esterno in alternativa ai modelli sulla dinamica di popolazione di cellule del SI presenti in bibliograa (33;34;36;52). Il primo modello concerne la dinamica di popolazione (DP) dei linfociti T vergini e di memoria utilizzando i dati sperimentali ottenuti dal Prof. Franceschi (23). Alcune ipotesi biologiche alla base del modello erano gia state confermate dai dati sperimentali, mentre altre sono innovative ed hanno dato un contributo positivo alla comprensione della dinamica linfocitaria. Nel secondo modello (EC)

7 introduzione 5 si prendono in considerazione le espansioni clonali (il clone e un insieme di cellule uguali tra loro derivanti dallo stesso progenitore) relative ai linfociti T, protagonisti della risposta immunitaria specica, utilizzando ancora una volta un approccio stocastico nella descrizione delle interazioni del SI con l'ambiente. I risultati ottenuti nel primo modello (DP) hanno dato, in primo luogo, una conferma teorica che la diminuzione di linfociti T vergini citotossici (CTL) e un adabile marcatore biologico della mortalita dell'essere umano; inoltre la modellizzazione di questo fenomeno ha permesso di ipotizzare un nuovo meccanismo alla base della diminuzione netta del repertorio cellulare di linfociti T vergini all'interno dell'organismo durante l'intero arco della vita. L'introduzione del termine stocastico ha fornito delle curve di sopravvivenza consistenti con quelle ottenute con rilevamenti demograci (22). Nel secondo modello si e mostrato l'eetto delle stimolazioni antigeniche aspeciche sul repertorio di linfociti T ed in particolare sulle dimensioni dei cloni. Poiche queste stimolazioni agiscono su scale di tempo lunghe i risultati ottenuti aprono nuove prospettive di indagine sull'eetto dello stress antigenico cronico, cui il SI e continuamente soggetto, nella risposta immunitaria specica. Ancora una volta, l'introduzione di un termine stocastico nell'interazione con l'ambiente ha permesso di comprendere il ruolo delle stimolazioni aspeciche nell'invecchiamento, suggerendo inoltre la necessita di nuovi dati sperimentali per lo studio degli eetti delle stimolazioni esterne di lunga durata sul comportamento globale del SI.

8 6 Modelli per l'immunologia Capitolo 1 Il Sistema Immunitario Umano In questo capitolo viene brevemente descritto il Sistema Immunitario (SI) umano sia in termini dei suoi costituenti fondamentali che dei suoi meccanismi di regolazione interna. Verranno anche sottolineate le similitudini e le dierenze con il SI di altri organismi di animali superiori quali ad esempio il topo e alcuni invertebrati. Il SI umano, puo essere considerato un Sistema complesso, poiche il suo funzionamento e basato su una complessa rete di interazioni non semplici tra le diverse cellule che lo compongono, e tra queste cellule e varie sostanze in soluzione. Data la complessita del sistema e l'enorme numero di variabili in gioco, una descrizione esaustiva del comportamento globale del SI e della mutua interazione dei suoi componenti non esiste ancora. Inoltre solo in questi ultimi anni si sono resi disponibili dati sperimentali sulle modicazioni a cui il SI va incontro sul lungo periodo, ovvero durante tutto l'arco della vita di un organismo Caratteristiche Generali del SI umano Il SI umano e una organizzazione complessa di organi,cellule e sostanze in soluzione il cui compito e quello di preservare l'integrita dell'organismo, difendendolo sia da agenti patogeni che da agenti autolesivi prodotti in condizioni siologiche e patologiche. Si denisce antigene qualsiasi elemento cellulare o molecolare in grado di innescare la risposta immunitaria che il SI esplica attraverso un sosticato coordinamento dei propri organi primari (timo, milza, midollo osseo, pelle), secondari (linfonodi,tessuti linfoidi, sangue e mucose) e delle diverse cellule che lo compongono (linfociti T e B, macrofagi, cellule dentritiche, cellule NK) e di tutta una serie di molecole

9 1 il Sistema Immunitario 7 in soluzione (1;2). Alcune di esse, gli anticorpi, hanno la capacita di individuare gli antigeni, altre, le citochine, svolgono un ruolo di mediatori intercellulari ed intracellulari per la regolazione della risposta immunitaria e sono dunquetra gli elementi fondamentali del network di trasduzione e regolazione del segnale biologico, ovvero per la comunicazione fra gli elementi che costituiscono il SI Il midollo osseo svolge la funzione di produzione di linfociti B e T (noti come leucociti o globuli bianchi) attraverso la differenziazione di un'unica cellula progenitrice, la cellula staminale ematopoietica, da cui si originano tutti gli elementi cellulari del sangue (globuli rossi e leucociti) (1). Nel timo, situato al centro del petto, avviene la maturazione dei linfociti T con lo sviluppo di particolari recettori di supercie attraverso i quali le cellule T sono in grado di riconoscere gli agenti patogeni ad essi presentati da altre cellule capaci di catturarli nell'organismo. Nel Timo inoltre, attraverso un meccanismo di selezione, si eliminano tutte le cellule T in grado riconoscere molecole proprie dell'organismo che di conseguenza darebbero origine ad una risposta immunitaria contro l'organismo stesso generando patologie autoimmuni (6;44). La circolazione sanguigna permette il trasporto delle varie cellule e molecole del SI verso i tessuti, il sistema linfatico ne permette il ritorno dalle aree periferiche dell'organismo no alla circolazione sanguigna a cui esso si raccorda attraverso la vena succlavia. I luoghi in cui avviene il riconoscimento antigenico da parte dei componenti il SI sono i linfonodi, la milza e l'area sottostante l'epidermide. I linfonodi sono aree del sistema linfatico disposti in punti strategici dell'organismo e aventi la funzione di ltro per il usso linfatico. In essi gli agenti patogeni e tutte le sostanze che devono essere riconosciute dal SI vengono sottoposti al vaglio delle cellule immunitarie. I linfociti B e T sono cellule specializzate nel riconoscimento specico di ogni sostanza o microorganismo che penetri nell'organismo ovvero esse sono capaci di distinguere le diverse forme strutturali dei diversi antigeni. I linfociti B, una volta riconosciuto l'antigene, si trasformano in plasmacellule ovvero grandi cellule in grado di rilasciare in

10 8 Modelli per l'immunologia soluzione gli anticorpi. Una volta eliminato il patogeno le cellule B si differenziano in cellule di memoria, capaci di sopravvivere per lunghi periodi di tempo e pronte a rispondere in maniera piu ecace contro un eventuale attacco dello stesso antigene. Anche le cellule T hanno una funzione di riconoscimento specico attraverso particolari strutture poste sulla loro super- cie denominate recettori. Tuttavia i linfociti T non rilasciano tali recettori in soluzione ed inoltre non riconoscono direttamente l'antigene ma solo quelle frazioni delle molecole antigeniche (peptidi) che vengono loro mostrate dalle cellule immunitarie in grado di espletare un riconoscimento diretto speci- co o no che sia. Il linfocita T puo legarsi ai peptidi e generare quindi la risposta immunitaria specica per quell'antigene. Tramite la pelle, oltre che per via orale, l'organismo riceve la gran parte degli agenti patogeni e proprio sotto di essa sono poste numerose cellule adibite al riconoscimento antigenico come le cellule dentritiche ed i macrofagi. Quest'ultimi sono grandi cellule mononucleate, migranti, che derivano da cellule precursorie del midollo osseo e sono presenti nella maggioranza dei tessuti dell'organismo. La loro funzione principale e la fagocitosi, cioe un meccanismo attraverso cui i macrofagi inghiottono e degradano intracellularmente gli antigeni che incontrano sul loro cammino mostrandone poi i frammenti sulla propria supercie. I macrofagi hanno la duplice funzione di eliminazione diretta del patogeno e di supporto alla risposta immunitaria dei linfociti T e attraverso la secrezione di citochine, anche di altre cellule del SI. Sotto la pelle e nelle mucose epiteliali sono strategicamente poste le cellule dentritiche (DC), cellule con una morfologia ramicata (o dentritica), tra i piu potenti stimolatori della risposta immunitaria nei tessuti linfoidi. Esse sono capaci di inglobare gli antigeni provenienti dall'esterno attraverso le aree periferiche e una volta attivate, ovvero dopo aver inglobato l'antigene, migrano verso aree ad alta concentrazione linfocitaria come i tessuti linfoidi. Qui stimolano, attraverso la produzione di citochine, la mobilita e la migrazione dei linfociti T verso le aree interessate dagli agenti patogeni precedentemente individuati. Alla risposta immunitaria contribuiscono anche le cellule NK (natural killer), linfociti granulari

11 1 il Sistema Immunitario 9 di grandi dimensioni, capaci di lisare alcuni tipi di cellule tumorali ed alcuni tipi di cellule infettate dai virus. Non e tuttavia ancora noto se queste cellule abbiano funzioni speciche, ossia se esplichino il riconoscimento antigenico oppure attuino l'uccisione delle cellule infettate in maniera cosiddetta naturale o non specica Immunita innata ed Immunita specica Una potente prospettiva in grado di aiutare a far luce nei molti interrogativi ancora oggi aperti su alcuni aspetti fondamentali che riguardano il ruolo ed il signicato biologico di alcuni componenti e funzioni del SI, e quella evolutiva. Verranno qui esposti i risultati di studi fatti in tal senso riguardanti il SI degli invertebrati e dei vertebrati cogliendo analogie e differenze e evidenziando il ruolo dell'evoluzione nella selezione di meccanismi di riconoscimento specico e di autoregolazione interna (18). Il lungo processo evolutivo subito dagli organismi vertebrati ha condotto infatti ad una struttura del SI che consta di due sottosistemi fortemente interconnessi: il primo, comune anche agli organismi piu semplici come gli invertebrati, e coinvolto nell'immunita innata o non specica, mentre il secondo, frutto dell'evoluzione degli organismi vertebrati, e quindi evolutivamente piu recente, e alla base dell'immunita clonotipica o specica. L'immunita innata e mediata da cellule, come i macrofagi e le cellule NK, da proteine circolanti nell'organismo, come il sistema del complemento e da numerosi peptidi antimicrobici. Tutte queste componenti dell'immunita innata utilizzano per identicare batteri e virus, meccanismi non specici ossia che non permettono di discriminare tra le strutture molecolari dei singoli antigeni. Negli organismi invertebrati e presente soltanto la risposta immunitaria non specica ed il riconoscimento degli organismi estranei che penetrano al loro interno si realizza attraverso l'identicazione di particolari molecole comuni a classi di microorganismi con cui i macrofagi, i monociti e le cellule dentririche vengono a contatto. Con l'aumento della complessita degli organismi di piu recente formazione,

12 1 Modelli per l'immunologia e con il cospicuo aumento del numero e della tipologia dei potenziali aggressori, il SI degli piu evoluti ha dovuto dotarsi di opportuni meccanismi di difesa che sono divenuti sempre piu specializzati nel riconoscimento di strutture molecolari estranee (2). La parte innata della risposta immunitaria, pur essendo un sistema con funzionalita non speciche, interagisce con l'immunita clonotipica in vari modi per adiuvarne i meccanismi di attivazione della risposta al patogeno. Sostanzialmente, si intravede, in una prospettiva evolutiva, come il SI abbia conservato e riutilizzato strutture e funzioni evolutivamente gia testate per dar vita ad una nuova struttura ed a funzioni sempre piu articolate con le quali le piu antiche si sono integrate. L'immunita di piu recente formazione presenta una struttura piu complessa e con un elevato numero di funzionalita. Al suo interno e possibile distinguere due tipi diversi di risposta immunitaria: una umorale e l'altra cellulare. La prima, coschiamata in quanto attuata attraverso la cooperazione tra cellule e molecole in soluzione, e mediata dai linfociti B e dagli anticorpi da essi liberati in soluzione; le cellule B attuano la risposta umorale successivamente al riconoscimento di antigeni in soluzione nei uidi cellulari come proteine, lipidi, sia che siano acidi nucleici o piccoli composti chimici. Il riconoscimento avviene attraverso dei recettori di supercie, costituiti da complessi molecolari denominati immunoglobuline o anticorpi, diversi da cellula a cellula e in grado di garantire un contatto sterico solo con particolari sequenze molecolari ad esso ani (3).Una volta avvenuto il contatto, le cellule B si dierenziano in plasmacellule in grado di liberare anticorpi specici per quell'antigene. Ciascun individuo ha contemporaneamente in circolo nel proprio organismo circa 1 8 tipi diversi di cellule B ed e questo elevato numero a caratterizzare il grado di specicita dei linfociti B. Gli anticorpi possono essere rilasciati in soluzione, ed a dierenza dei linfociti T, sono in grado di riconoscere i peptidi nell'ambito dell'organismo a cui appartengono, senza previa frammentazione e senza il supporto di ulteriori strutture molecolari mediatrici. L'immunita cellulare, come evidenzia la denominazione stessa, si basa invece sull'interazione e cooperazione tra cellule. Protagonosti di questo tipo di

13 1 il Sistema Immunitario 11 risposta sono i linfociti T. Le cellule che vengono a contatto con virus, batteri intracellulari, microorganismi e loro prodotti, li captano dall'ambiente extracellulare e li inglobano nel proprio metabolismo divenendo cellule infette. All'interno di ciascuna cellula esistono dei meccanismi di processazione delle sostanze proteiche intracellulari che agiscono anche sulle proteine prodotte dall'antigene. Dopo che quest'ultimo e stato frammentato intracellularmente in piu parti, la cellula infetta presenta sulla sua supercie, i prodotti della frammentazione antigenica (4) legandoli su particolari molecole poste sulla propria supercie. Queste molecole di supercie sono chiamate molecole MHC in virtu del fatto che esse sono codicate da particolari geni coinvolti nei meccanismi di rigetto dei trapianti denominati geni del Complesso Maggiore di Istocompatibilita (MHC dall'inglese Major Histocompastibility Complex). Nell'uomo queste molecole possono essere di tre tipi di cui solo quelle di classe I e II (MHC I, MHC II) sono rilevanti per il SI. Ogni cellula del nostro organismo, tranne pochi tipi di esse come i neuroni e gli spermatozoi, presenta in supercie molecole MHC I e solo alcune cellule appartenenti al SI presentano anche quelle di classe II e sono i linfociti B, le cellule dentritiche ed i macrofagi. Poiche queste molecole entrano in meccanismi chiave del riconoscimento immunitario e poiche esse sono tipiche di ciascun individuo, costituendo una sorta di carta d'identita di ciascuno di noi, esse vengono usate dalle cellule del SI per l'autoriconoscimento, noto con il termine di "riconoscimento del se' ". Le molecole MHC presentano i frammenti antigenici in particolari siti a forma di tasca da cui possono essere riconosciuti per contatto sterico dai linfociti T tramite dei composti molecolari posti sulla loro supercie denominati TCR (T Cell Receptor). Quindi la specica forma tridimensionale che il complesso MHC assume funge da chiave per l'attivazione della risposta immunitaria. Questo processo di riconoscimento doppiamente specico, poiche presuppone il riconoscimento delle proprie molecole MHC in complesso con il peptide specico dell'antigene, e noto come Restrizione MHC ed e valso il nobel ai ricercatori che per primi lo hanno individuato (Zinkernagel e Doherty). Data la loro funzione, le cellule sulla cui supercie

14 12 Modelli per l'immunologia sono poste le molecole MHC tramite cui i linfociti T riconoscono i frammenti antigenici, sono chiamate cellule presentanti l'antigene (APC, antigen presenting cells). La cellula T e in grado di riconoscere un agente patogeno soltanto attraverso queste cellule che possono essere sia linfociti B, che hanno gia riconosciuto l'antigene, oppure cellule non speciche come i macrofagi, le cellule dentritiche e le cellule NK. Nonostante il meccanismo di restrizione MHC sia prerogativa dei linfociti T, esso risulta comunque fondamentale per l'indiretta stimolazione e la corretta funzionalita dei linfociti B. Questi infatti per essere attivati, proliferare e trasformarsi in plasmacellule devono oltre che riconoscere l'antigene, ricevere anche un secondo segnale di costimolazione. Quest'ultimo e originato da particolari linfociti T denominati T helper coschiamati proprio per la loro funzione coadiuvante nella risposta umorale. I linfociti T si distinguono in T helper e T citotossici (CTL, Cytotoxic T Lynfocites) aventi ruoli diversi nell'ambito della risposta immunitaria. All'interno di queste sottoclassi esistono poi ulteriori suddivisioni in ragione dell'ambito in cui la risposta immunitaria ha luogo. Ad esempio i Th si dividono in Th1 e Th2 a seconda che la funzione coadiuvante si attui in assenza o presenza rispettivamente di un processo inammatorio. In questo caso infatti le citochine prodotte sono diverse per tipo e quantita ed inuenzano diversamente le funzioni ed il comportamento di altre cellule del SI e non (4). Poiche e scopo del SI eliminare le cellule infettanti od infettate, i meccanismi di riconoscimento dei B e T linfociti sono in realta di supporto ai meccanismi di uccisione delle cellule che fanno appello al sistema del complemento ed ai CTL nel caso della risposta umorale e della risposta cellulare rispettivamente. Il sistema del complemento e una complessa organizzazione enzimatica che viene attivato dagli anticorpi liberati in soluzione che aderiscono alle porzioni antigeniche delle cellule patogene che sono in grado di riconoscere. La lunga successione di fasi enzimatiche cooperano per la realizzazione di una struttura proteica cilindrica che penetra nella membrana cellulare ed alla ne ne provoca la lisi. I linfociti T citotossici sono invece deputati all'eliminazione di cellule infettate da virus

15 1 il Sistema Immunitario 13 o di cellule alterate dello stesso organismo come le cellule tumorali. I virus infatti sfruttano i meccanismi della cellula ospite per farle produrre proteine a loro utili mentre le cellule tumorali producono proteine anomale che non vengono quindi riconosciute come prodotto del metabolismo dell'organismo stesso. Tutte le sostanze che risultanti dal metabolismo cellulare vengono processate e frammentate intracellularmente ed i dierenti frammenti prodotti compaiono in seguito nella tasca delle molecole MHC di classe I. I complessi MHC I-peptide sono individuati dai TCR dei CTL, e quando l'anita dei recettori per il complesso molecolare e sucientemente alta, queste cellule vengono attivate e producono inne la lisi delle cellule infette o malfunzionanti. La ragione per cui praticamente tutte le cellule presentano MHC I e che sono tutte potenzialmente infettabili e devono essere quindi tutte eliminabili da parte dei linfociti citotossici. Poiche la reazione immunitaria e altamente lesiva, e dato che si conclude con l'eliminazione di cellule, e estremamente importante che essa avvenga in condizioni di sicurezza per non apportare lesioni ad organi e cellule non coinvolte in infezioni o alterazioni patologiche, e danneggiare di conseguenza immotivatamente l'organismo. Per fare questo il SI ha sviluppato una serie di complessi e sosticati meccanismi di controllo basati su segnali di costimolazione, in assenza dei quali la risposta immunitaria non ha luogo. Questi intervengono in diverse fasi dello sviluppo cellulare, dalla nascita della cellula no alla sua morte, decidendo non solo il destino della risposta, ma anche quello della cellula stessa. Di questi segnali citiamo per brevita solo alcuni come quelli mediati dalle molecole di super- cie dei linfociti Th e T citotossici. Questa mediazione avviene tramite le molecole CD4 e CD8 rispettivamente per i linfociti Helper e citotossici che vengono anche utilizzati in laboratorio come marcatori per il riconoscimento dei due sottogruppi linfocitari. In denitiva, si puo concludere dicendo che lo stesso virus o batterio puo essere combattuto dal sistema immunitario sia che esso sia penetrato nelle cellule dell'organismo ospite sia che esso sia in soluzione nei vari sottosistemi periferici o in un generico uido biologico all'interno dell'organismo. I meccanismi di riconoscimento sia delle cellule

16 14 Modelli per l'immunologia B che delle T presentano due caratteristiche fondamentali che permettono di considerare il SI tra i sistemi biologici dotati di capacita cognitive. Essi sono l'alta specicita per i determinanti antigenici degli agenti patogeni e la capacita di memorizzarne le sequenze. Infatti entrambi i tipi di linfociti dopo l'attivazione si dierenziano in cellule eettrici, che portano avanti la risposta immunitaria e cellule memoria, che permangono in uno stato quiescente all'interno del sistema in attesa di essere ristimolate ad un secondo ingresso dello stesso patogeno nell'organismo. Cio permette di ottenere in caso di successive riesposizioni allo stesso antigene, una risposta immunitaria piu veloce ed ecace. E soprattutto questa immunita specica che caratterizza i vertebrati e costituisce la parte del sistema a piu elevato livello di complessita riscontrabile sia nella vasta gamma di cellule in gioco, che nei sosticati meccanismi di riconoscimento e regolazione della risposta che ne sono caratteristici. Ogni risposta e il frutto sia di una decodica delle informazioni contenute nel patrimonio genetico dell'individuo(selezione dei recettori specici dei linfociti) sia da una parziale stocasticita nella "scelta " di particolari strutture molecolari utilizzate nel meccanismo di riconoscimento sia dal contenuto informativo che giunge dall'ambiente esterno in cui l'organismo si nutre ed interagisce con altri esseri viventi "immunologicamente diversi". La specicita della risposta sta proprio nella estrema diversita dei recettori dei diversi cloni. A fondamento di queste osservazioni sperimentali vi e una teoria fondamentale in immunologia, la selezione clonale, formulata da Burnet nel In essa si sostiene che la specicita per i diversi antigeni che il SI man mano riconosce, esiste gia prima dell'incontro con l'antigene. Nell'organismo infatti, sono gia presenti tutte le informazioni che possono dare vita al riconoscimento di una qualunque struttura polipeptidica che venga a contatto con il sistema immunitario. Queste informazioni sono codicate nel patrimonio genetico sotto forma di geni costituiti da piu sequenze codicanti per la stessa porzione della proteina recettoriale, tra i quali la cellula sceglie in maniera casuale quelli da mettere insieme per generare il proprio recettore Dunque, lo

17 1 il Sistema Immunitario 15 Figura 1.1.1Attacco patogeno e risposta immunitaria. sviluppo di cloni linfocitari antigene-specici si verica prima dell'esposizione agli antigeni, in maniera del tutto indipendente da essi ed inoltre facendo uso di un numero limitato di segmenti genici. Tale processo, noto con il nome di ricombinazione somatica, avviene durante lo sviluppo e la maturazione delle cellule linfocitarie. Da un calcolo delle possibili combinazioni di tali sequenze geniche si stima che tutti i possibili linfociti B prodotti da un individuo sono

18 16 Modelli per l'immunologia circa 1 12 ed i possibili linfociti T sono circa L'esistenza di una cellula con un recettore opportuno per un antigene qualunque e quindi un evento altamente probabile e la sua formazione all'interno dell'organismo avviene in un tempo ragionevolmente breve. Lo sviluppo dei recettori di supercie per i linfociti Til ha luogo nel Timo, dove, dopo il riarrangiamento genico, essi vengono ancorati all'esterno della cellula, rendendo tali cellule pronte a riconoscere strutture peptidiche sia estranee che proprie dell'organismo. Il problema del riconoscimento di autoantigeni da parte dei linfociti, cioe di sostanze non dannose per l'organismo ma ad esso appartenenti, viene in gran parte risolto attraverso un duplice processo selettivo all'interno del Timo noto come selezione timica positiva e negativa. Durante la maturazione nel timo, i linfociti riarrangiano i geni per la generazione dei TCR e conseguentemente sono in grado di riconoscere i complessi peptide-mhc presenti sulle cellule APC che in quel momento transitano nella regione timica. Di questi linfociti sopravviveranno soltanto quelli con una discreta capacita di riconoscimento per le proprie molecole MHC. Questo processo e noto come selezione positiva. Essa tuttavia non impedisce la maturazione delle cellule T dotate di una forte anita di legame per i complessi MHC-antigene (4). Devono pertanto entrare in gioco meccanismi detti di selezione negativa in grado di eliminare queste cellule fortemente autoreattive e quindi pericolose per l'attivazione di risposte autoimmuni. Alla ne soltanto le cellule con bassa anita per le sole molecole MHC e con medio alta anita per i complessi MHC-autoantigene sopravvivono e maturano. La selezione negativa e anche nota come tolleranza principale ed e mediata da meccanismi di morte cellulare basata su reti di segnali che inducono la cellula a morire (apoptosi). Esistono, come gia accennato, altre tolleranze periferiche che coinvolgono cellule non speciche. Non tutti gli autoantigeni infatti possono penetrare nel timo ed e quindi possibile che un certo numero di cellule T autoreattive vadano in maturazione. A questo stadio possono solo intervenire meccanismi periferici di inibizione di una eventuale risposta autoimmune. Cio puo essere fatto attraverso due diverse vie: l'apoptosi, ossia la morte cellulare programmata, e l'anergia,

19 1 il Sistema Immunitario 17 ovvero l'incapacita da parte delle cellule di rispondere ad un segnale mediato dai propri recettori con conseguente perdita delle proprie funzionalita. Questi meccanismi di tolleranza periferica si attivano sempre tramite segnali di costimolazione, che nella maggior parte dei casi provengono da cellule non speciche, ma altamente specializzate nella regolazione delle risposte clonotipiche come le cellule dentritiche. Queste ultime, come vedremo in seguito, probabilmente hanno un ruolo sostanziale anche nel mantenimento dei cloni di cellule memoria. La tolleranza a cui sono soggetti i linfociti T, prima nel timo e successivamente nel sistema periferico, conferma l'ipotesi secondo cui l'interazione tra l'immunita innata e quella clonotipica e di fondamentale importanza per la sopravvivenza delle cellule speciche. Questa interazione, media non solo i meccanismi di sotto regolazione (o di soppressione), ma anche l'espansione clonale dei linfociti e la loro sopravvivenza nel tempo. Un ruolo fondamentale nei meccanismi di interazione e comunicazione tra i due sottosistemi immunitari e dato dalle citochine prodotte sia da cellule aspeci- che sia dai linfociti T e B. Queste molecole prodotte durante la risposta immunitaria, regolano l'attivazione la crescita e la dierenziazione linfocitaria dopo il riconoscimento antigenico, nonche permettono l'interazione del SI con altri sistemi dell'organismo quali il sistema endocrino ed il sistema nervoso. Poiche infatti il corpo umano, come insieme di complessi sistemi biologici, deve continuamente regolare i propri meccanismi interni in seguito alle stimolazioni provenienti dall'esterno, occorre considerare il SI umano come una complessa rete di sottosistemi piu o meno specializzati in continua interazione con l'ambiente esterno e con altri apparati dell'organismo quali il sistema endocrino e quello nervoso. Il riconoscimento antigenico, l'autoregolazione a cui il SI deve ricorrere in seguito alle espansioni clonali di cellule altamente tossiche anche per l'organismo e la complessa rete di interazione tra immunita innata e colonotipica costituiscono una sorta di equilibrio dinamico dove a seconda delle condizioni esterne a cui il sistema e soggetto si ha una prevalenza dell'uno sull'altro elemento.

20 18 Modelli per l'immunologia Il ciclo della risposta immunitaria I microrganismi che un normale individuo sano incontra nella vita solo raramente sono causa di malattia percettibile. La maggior parte di essi viene individuata e distrutta nel giro di poche ore da parte di sistemi di difesa non antigene-specici che coma gia detto costituiscono la cosiddetta immunita innata. Solo nel caso in cui un microorganismo infranga queste prime difese o un composto molecolare venga a contatto con cellule del sistema, si innesca una risposta immunitaria adattiva, con la generazione di cellule eettrici antigene-speciche, indirizzate specicamente contro l'agente patogeno, e di cellule di memoria in grado di prevenire una ulteriore infezione contro lo stesso patogeno. La prima fase di ogni risposta adattiva consiste nell'attivazione delle cellule T vergini negli organi linfoidi periferici, drenanti il liquido interstiziale. Gli antigeni provenienti dai tessuti periferici vengono bloccati e processati nei linfonodi dalle cellule APC ed il continuo ricircolo delle cellule T garantisce che quest'ultime, possano incontrare l'antigene per cui sono speciche esposto sulle APC. Successivamente avviene il dierenziamento dei linfociti T vergini in cellule eettrici e cellule di memoria. Le modalita esatte con cui avviene questo meccanismo non sono ancora note completamente benche si sia messo in evidenza il ruolo determinante di particolari citochine prodotte nelle fasi precoci della risposta da parte di macrofagi e cellule NK. Un altro fattore che inuenza il dierenziamento delle cellule T helper in Th1 ed in Th2 e la concentrazione dello specico complesso peptide- MHC di classe II sulle APC specializzate. Se il legame ha una densita molto elevata esso tendera a stimolare risposte inammatorie (Th1) mentre se la presentazione e meno densa tendera a suscitare una risposta a cellule coadiuvanti per i linfociti B. Successivamente ha luogo l'espansione clonale, in cui i linfociti specici per quell'antigene sono attivati e cominciano a dividersi una volta che, sotto opportune costimolazioni, raggiungono i tessuti periferici soggetti all'attacco. Il numero di linfociti cresce in maniera esponenziale su scale temporali diverse a seconda del tipo di linfocita: i primi linfociti a completare l'espansione clonale sono i T helper dato il loro ruolo fondamentale

21 1 il Sistema Immunitario 19 per l'attivazione della risposta umorale. Dopo alcuni giorni tutte le cellule T attivate possiedono tutte funzioni eettrici: la prevalenza della risposta umorale nei tessuti linfatici o di quella cellula mediata nei siti di infezione nei tessuti dipendera dalla produzione cellulare non specica (non adattativa) di citochine. Dopo che il carico antigenico e stato ridotto le cellule eettrici subiscono un processo di contrazione con cui gradualmente vengono eliminate circa il 95% delle cellule T speciche per l'antigene. Questa contrazione e nota come "morte cellulare indotta da attivazione" (AICD) ed e il meccanismo principale di regolazione per gli stessi linfociti T nella fase successiva a quella eettrice. Tale processo, indotto da particolari segnali come il Fas, una sostanza proteica capace di legarsi a dei recettori di supercie dei linfociti T noti come CD95, induce la cellula ad autodistruggersi in modo tale che il numero di linfociti antigene-specico torni su un livello di normalita e siano evitati danni all'organismo. Ad esempio i linfociti CTL hanno una elevata tossicita ed una loro massiccia presenza nell'organismo puo indurre alla eliminazione di cellule proprie dell'organismo senza che queste siano state infettate. L'ultima fase e quella di memoria, dove la presenza di cloni linfocitari antigene-specici induce il SI verso una congurazione tale da poter rispondere piu rapidamente ad eventuali attacchi di patogeni gia incontrati in precedenza. Uno dei punti ancora oscuri nello studio del funzionamento del SI riguarda il momento e le modalita con cui avviene la dierenziazione tra cellule T eettrici e cellule T di memoria. A questo riguardo sono state formulate diverse ipotesi, alcune delle quali verranno esposte nel paragrafo successivo.

22 2 Modelli per l'immunologia 1.2 Memoria immunologica Origine delle cellule memoria Durante una risposta immunitaria clonotipica, in seguito al riconoscimento antigenico, si attua una ingente espansione clonale di linfociti T e B attivati relativi al determinato antigene che ha stimolato la risposta. In questa espansione, che avviene sia nei tessuti periferici interessati dall' attacco antigenico sia nei ussi linfoidi, il numero di cellule eettrici passa da un valore approssimativo di circa 1 2 ad un valore di 1 12 per entrambi i linfociti T e B. Dopo la fase eettrice in cui il carico antigenico presente nell'organismo viene quasi completamente distrutto, i cloni espansi sono soggetti ad un processo biochimico che induce alla morte cellulare programmata in seguito a stimolazione da parte di alcune citochine prodotte dai linfociti T helper durante la loro fase di attivazione e in seguito all'attivazione di meccanismi di soppressione mediati dal reciproco contatto degli stessi linfociti attraverso molecole di supercie stericamente complementari quali il Fas ed il Fas ligando (45). Sostanzialmente, le cellule eettrici e le cellule memoria posseggono sulla loro supercie degli opportuni recettori denominati CD95, o anche FAS, sensibili al contatto con una molecola proteica denominata Fas-ligando (Fas-L), anch'essa posta sulle supercie dei linfociti T. Ogni cellula T eettrice possiede sulla propria supercie un'elevata concentrazione di molecole Fas-L e di recettori CD95 in modo tale che, dopo la fase acuta della risposta immunitaria, il contatto tra il Fas di un linfocita ed il FAS-L di un'altro linfocita attivi un processo di apoptosi che riduca il numero di cellule dei cloni stimolati per riportarlo a valori tipici della fase quiesciente. La fase successiva della risposta immunitaria e quella protettiva, che vede la comparsa nell'organismo di cellule memoria del o dei cloni stimolati, che predispongono l'organismo a rispondere in maniera piu eciente e su una scala di tempi piu breve, ad eventuali attacchi antigenici successivi a quello che le ha generate. A tutt'oggi tuttavia, il problema di come e quando

23 1 Memoria immunologica 21 nel corso della risposta immunitaria le cellule memoria vengano generate e permangano poi a lungo nell'organismo non ha ancora trovato una soluzione soddisfacente. Il dibattito scientico ruota sostanzialmente attorno a due visioni opposte (15;17) : da una parte si postula che la memoria immunologica sia dovuta a cellule a vita molto lunga, capaci di sopravvivere anche per decenni all'interno dell'organismo scampando a tutta una serie di stimoli che ne indurrebbero la morte. Dall'altra parte si ipotizza che la memoria sia il risultato di un continuo processo di stimolazione di nuove cellule con sopravvivenza limitata. Questa stimolazione sarebbe dovuta alla presenza di piccole concentrazioni antigeniche che permangono nell'organismo dopo la fase acuta, in alcuni siti specici e nei vari tessuti periferici e capaci di indurre una sorta di microrisposta continua nel tempo tale da mantenere costante il numero di cellule che costituiscono il clone memoria. I cloni espansi di linfociti sono riscontrabili nell'organismo anche dopo lunghi periodi di tempo successivi al contatto con l'antigene specico che ne ha indotto la formazione e la successiva espansione. Si puo osservare tuttavia, che sono immuni solo individui che siano essi stessi stati esposti in precedenza ad un determinato agente infettivo, e la memoria non si mantiene se vengono continuamente re-infettati altri individui. Questo e stato accertato osservando popolazioni su isole remote, dove un virus come il morbillo puo causare un'epidemia, infettando contemporaneamente tutta la gente che vive sull'isola scomparendo poi per molti anni (2). A seguito di una reintroduzione dall'esterno, il virus non colpisce piu la popolazione originale, ma causa malattia in tutti coloro che sono nati dopo la ne dell'epidemia iniziale. Questo signica che la memoria immunitaria non puo essere causata da ripetute esposizioni al virus ma puo soltanto essere generata all'interno dell'individuo gia aetto dal carico antigenico. Se per i linfociti B le caratteristiche del fenomeno della memoria immunologica risultano essere abbastanza chiare, di piu dif- cile interpretazione ed individuazione sono le caratteristiche della memoria immunologica proprie delle cellule T. Per quanto riguarda infatti i linfociti

24 22 Modelli per l'immunologia B, grazie alle modalita con cui si esplica la risposta immunitaria di tali cellule, e stato piu semplice, dal punto di vista sperimentale, chiarire l'origine delle cellule memoria. L'elevata concentrazione del carico antigenico, unito all'intensita dei segnali costimolatori mediati dal contatto reciproco delle molecole di supercie e dalle citochine, inducono la generazione di cellule di memoria. Inoltre, le cellule B di memoria esprimono sulla loro supercie un livello di molecole MHC di classe II superiore a quello caratteristico delle cellule B vergini, che ne facilita la captazione dell'antigene e la sua presentazione, permettendo alle cellule T "helper" di intervenire con la loro stimolazione anche in presenza di un minor carico antigenico. Le cellule T di memoria sono piu dicili da caratterizzare e quindi da individuare nelle procedure sperimentali rispetto alle cellule memoria di tipo B. Dunque a tutt'oggi non si e individuato ancora un meccanismo univoco in grado di spiegare la dierenziazione tra cellule vergini, attivate e di memoria per i linfociti T Modelli teorici per le cellule T di memoria Sono stati formulati vari modelli per la descrizione delle cellule T di memoria, fra i quali ve ne sono 4 che sembrano i piu attendibili (14). Il primo modello si basa sui meccanismi con cui avviene la generazione dei linfociti B di memoria, ipotizzando che la cellula T di memoria segua una sua evoluzione indipendente dalle cellule eettrici che sono state generate durante la risposta primaria. Le cellule vergini si dierenzierebbero in cellule eettrici o in cellule memoria dipendentemente dalla frequenza e dalla concentrazione del carico antigenico e dalla presenza o meno di fattori di costimolazione. Una elevata concentrazione antigenica indurrebbe i linfociti attivati a dierenziarsi in cellula eettrice (come le plasmacellule per i linfociti B che ricordiamo

25 1 Memoria immunologica 23 sono le produttrici di grandi quantita di anticorpi ) mentre un basso carico antigenico indurrebbe la generazione di cellule memoria. Il secondo modello ipotizza l'esistenza iniziale di due tipi distinti di cellule precursorie le quali, una volta attivate, diventano cellule eettrici e cellule di memoria. Ovviamente questi processi avvengono separatamente ed indipendentemente dal carico antigenico e dalla costimolazione presenti durante la risposta immunitaria. Un terzo modello che sembra essere tra i piu accreditati per la generazione di cellule T di memoria presuppone un processo di dierenziazione lineare. Le cellule memoria sarebbero prodotte direttamente dalle cellule eettrici ipotizzando l'esistenza di meccanismi in grado di discriminare le cellule che andranno incontro ad apoptosi, fase che deve necessariamente seguire alla fase eettrice per l'eliminazione dall'organismo di quelle cellule che, una volta neutralizzato l'antigene, diventerebbero potenzialmente dannose per l'organismo stesso. Dopo la fase repressiva, nell'organismo sopravviverebbero soltanto un numero ridotto di cellule che muterebbero in linfociti T di memoria. Ancora oggi questi meccanismi di regolazione sono in gran parte sconosciuti nonostante sia stata riscontrata una dipendenza nella generazione di cellule memoria dalla anita dei TCR e dalla quantita di antigene a cui le cellule eettrici sono soggette. L'ultimo modello e molto recente e si basa sulla dipendenza del processo di dierenziazione delle cellule vergini dal livello di stimolazione a cui esse sono soggette. Esso presuppone infatti che le cellule vergini, una volta attivate, continuino a dierenziarsi ad ogni elevata stimolazione antigenica trasformandosi in cellule eettrici. In questo modo il numero delle cellule che rischiano di andare incontro all'apoptosi aumenta sempre piu mentre contemporaneamente diminuisce la probabilita di generazione di cellule memoria, poiche la loro maturazione necessita sia di un basso carico antigenico sia di cellule precursorie che non abbiano gia raggiunto lo stato terminale di dierenziazione. Nonostante siano stati individuati da lungo tempo i protagonisti della risposta immunitaria specica ossia le cellule vergini di tipo B e T, le

26 24 Modelli per l'immunologia Figura Modelli teorici per la memoria immunologica.

27 1 Memoria immunologica 25 Figura Risposta immunitaria specica primaria e secondaria. plasmacellule prodotte dopo l'attivazione, le cellule eettrici di tipo T e le rispettive cellule di memoria, poco note sono le modalita con cui tali cellule sopravvivono nell'organismo e soprattutto quali siano i tempi di mantenimento dei vari repertori cellulari nei vari tessuti periferici durante la fase in cui l'attacco antigenico e assente e le cellule si trovano in uno stato immunologico quiesciente. Recenti dati sperimentali sono in favore dell'ipotesi secondo cui la preservazione dei linfociti vergini maturi richiede un continuo segnale stimolatorio generato dal riconoscimento da parte dei loro recettori TCR delle molecole MHC I espresse da quasi tutte le cellule del nostro organismo analogamente a quanto succede durante la selezione positiva nel timo (16). Diversamente

28 26 Modelli per l'immunologia da questo processo sembra che il compartimento dei T Helper non necessiti di un contatto cosrestrittivo come nella selezione timica (15). Infatti, in topi geneticamente modicati in modo da non possedere le cellule dentritiche, che hanno il compito di presentare l'antigene ai T linfociti, le cellule T helper vergini non vengono riscontrate nei tessuti periferici (8;17). Un processo analogo, ovvero che presuppone una continua stimolazione delle cellule memoria e stato ipotizzato per spiegare il fatto che tali cellule continuano a proliferare nei tessuti ed organi periferici anche dopo l'eliminazione dell'antigene e quindi della risposta immunitaria specica. I possibili segnali che potrebbero contribuire al mantenimento delle cellule in assenza di carico antigenico possono essere individuati nei recettori per le linfochine, ovvero per i segnali di costimolazione e di adesione con molecole in soluzione che le cellule memoria, a dierenza delle cellule vergini, esprimono sulla propria supercie in numero molto maggiore. Un ulteriore elemento che gioca un ruolo decisivo nella sopravvivenza dei linfociti memoria e il meccanismo di cross-reattivita. Con tale termine si intende la reattivita di cloni a non alta specicita per un antigene per il quale esistono linfociti con TCR con elevata anita. Infatti il risultato della frammentazione di antigeni diversi, atta ad ottenere corte sequenze antigeniche (epitopi) in grado di essere poste nella tasca delle molecole MHC e quindi di essere riconosciute dai TCR, possono presentare dei sottosegmenti aventi sequenze comuni a piu sostanze, microorganismi o virus in grado quindi di stimolare a diversi gradi di intensita, cloni diversi di cellule T. Ne segue, dunque, che un clone di cellule memoria generatosi per stimolazione altamente specica, continui ad essere in seguito stimolato dalla presenza di antigeni diversi da quello per cui il clone era specico (4;9;11;15). In realta questo meccanismo di stimolazione incrociata non funziona solo per eetto di grandi quantita di antigene (come quelle che sono presenti nelle infezioni acute), ma, e forse soprattutto, per eetto di continue microstimolazioni dovute alla permanenza di tracce antigeniche anche dopo che l'infezione e stata neutralizzata. Infatti dopo che nella risposta immunitaria specica l'antigene e stato rimosso dal corpo