Esercitazione di microbiologia generale. Isolamento

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1 Esercitazione di microbiologia generale Isolamento

2 Per conoscere le le proprietà di specie di microrganismi che convivono nel medesimo ambiente dovremo riuscire a: Letteralmente separarli fisicamente gli gli uni uni dagli dagli altri; altri; Farli Farli crescere separati in in laboratorio in condizioni artificiali. Operazioni fondamentali dell indagine microbiologica ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE

3 Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) con cui convive. Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su un substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una popolazione di cellule appartenenti ad un unica specie. Coltura pura o axenica Coltura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di una singola cellula microbica

4 TECNICHE DI SEMINA E ISOLAMENTO Presupposto fondamentale per lo studio e l identificazione dei m.o., isolati dai vari materiali sottoposti all esame microbiologico, è quello di disporre di una coltura pura Per coltura pura si intende l insieme delle cellule che si ottengono dalla riproduzione di una sola cellula iniziale

5 TECNICHE DI ISOLAMENTO Per ottenere una coltura pura è quindi necessario : diluire il campione iniziale per separare le cellule presenti (isolamento) trasferire una singola colonia in un terreno sterile in modo da ottenere una popolazione di cellule identiche (coltura pura)

6 TECNICHE DI ISOLAMENTO ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA ISOLAMENTO PER COLTURA MONOCITOGENETICA

7 ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO E necessario un terreno agarizzato su piastra Petri Si depone sul terreno una piccola quantità del campione da analizzare (popolazione mista) Con l ansa si striscia il campione su tutta la piastra Il sistema può variare in relazione al percorso da far seguire all ansa sulla superficie dell agar

8 ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 1

9 ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 2

10 ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale: le «strisciate» iniziali rilasceranno molte cellule che daranno origine, dopo incubazione, ad una patina Il progressivo esaurimento del carico dell ansa determinerà alla fine la semina di poche cellule separate tra loro.

11 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento

12 Semina per isolamento

13 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento

14 ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA È necessario preparare una serie di provette contenenti acqua sterile, soluzione salina o terreno liquido Il campione viene inoculato in modo tale che ciascuna provetta riceva una certa quantità della sospensione cellulare della provetta precedente In questo modo ciascuna provetta rappresenta una determinata diluizione del campione iniziale

15 ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Campione iniziale 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml Diluizione

16 ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione viene depositata su terreno agarizzato già solidificato Con una bacchetta di vetro si spande il campione su tutta la piastra A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre

17 ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO E PER DISSEMINAZIONE DILUIZIONI

18 SEMINA E ISOLAMENTO PER INCLUSIONE Piastramento per inclusione: un volume noto di coltura viene pipettato su una piastra Petri sterile, viene poi aggiunto il terreno agarizzato ancora fuso ma non troppo caldo (45-48 C). Il terreno viene mescolato alla coltura. Viene utilizzato per lo sviluppo di mo anaerobi

19 ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione viene depositata su terreno agarizzato già solidificato Con una bacchetta di vetro si spande il campione su tutta la piastra A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre

20 Isolamento per coltura monocitogenetica Questo tipo di isolamento permette di poter catturare una cellula dalla piastra di coltura mediante l utilizzo di un ago capillare. In questo modo si ha l assoluta certezza di aver isolato una singola cellula a b c d micromanipolatore Capillare con il quale vengono posizionate le cellule sulla piastra (ingrandimento) Posizionamento delle cellule su terreno completo. Le cellule sono posizionate a quattro a quattro. I numeri e le lettere indicano La posizione di ogni cellula

21 ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2) Forma Rilievo puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato circolare piatto filamentos a rizoide irregolare, a filo intrecciato irregolare, ramificata sopraelevato convesso irregolare umbonato

22 ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2) Superficie Margine liscia intero rilevata ondulata ondulato radiata eroso concentrica rugosa anelli concentrici raggrinzita filamentoso arricciato

23 ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche Capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio Presenza di particolari enzimi Produzione di specifici prodotti metabolici terminali Capacità di fermentare particolari zuccheri