C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione.

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1 Soluzioni ai problemi del Capitolo 12 Domande concettuali C1. A. I geni dei trna codificano molecole di trna e i geni degli rrna le molecole di rrna che si trovano nei ribosomi. Esistono anche dei geni non strutturali che codificano gli RNA degli SNRP e altri complessi. B. Il termine stampo è appropriato, perché uno dei due filamenti di DNA viene usato come stampo per la sintesi dell RNA. Il termine codificante è meno appropriato perché i geni non strutturali non codificano una sequenza polipeptidica. C. Sì C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione. C3. Una sequenza consenso è quella più frequentemente osservata in un gruppo di sequenze correlate tra loro. Per esempio le sequenze consenso -35 e -10 si trovano nei promotori batterici. A - 35 la sequenza è TTGACA, ma in presenza di piccole differenze di uno o due nucleotidi funziona ancora efficacemente. Nelle sequenze consenso dei promotori batterici il sito -35 è il principale sito di riconoscimento del fattore sigma. Il sito -10 si chiama anche Pribnow box ed è la posizione in cui la doppia elica si dissocia e inizia la trascrizione. C4. GGCATTGTCA C5. Le mutazioni che rendono una sequenza più simile alla sequenza consenso dovrebbero essere mutazioni up, mentre quelle che deviano dalla sequenza consenso dovrebbero essere mutazioni down. Inoltre, alla regione -10 le coppie AT sono favorite rispetto a quelle GC, perché il ruolo di questa regione è la formazione del complesso aperto. Le coppie AT si separano più facilmente perché contengono due soli legami idrogeno contro i tre della coppia GC. A. Promotore up B. Promotore down C. Promotore up C6. Le posizioni maggiormente conservate sono la prima, la seconda, e la sesta. In generale, quando le sequenze del promotore sono conservate, è più probabile che siano importanti per il legame. Questo spiega perché non si trovano variazioni della sequenza in queste posizioni; se una mutazione altera una posizione conservata, probabilmente il promotore non lavorerà appropriatamente. In confronto, le variazioni della quarta posizione sono tollerate occasionalmente, e lo sono spesso quando cadono nella terza o nella quinta posizione. Le posizioni che tollerano le variazioni sono meno importanti per il legame del fattore sigma. C7. Ciascuna α elica occupa una regione che è pari a circa la metà di un giro completo dell elica. Siccome un giro comprende 10 bp, ogni α elica si lega a circa 5 bp del solco maggiore del DNA. 5 bp corrispondono a circa 1,7 nm, come si vede nella Figura 9.9 del Capitolo 9. Dividendo 1,7 nm per 0,15 nm/aminoacido, si ottiene un valore di 11,3 aminoacidi per elica. Ciò corrisponde a circa 3,15 giri di α elica; ci sono tre giri completi per ciascuna delle due α elica, per un totale di sei giri. C8. Questo non influenzerà la trascrizione, tuttavia influenzerà la traduzione impedendo l inizio della sintesi del polipeptide. C9. L oloenzima consiste del fattore sigma più il core, composto da cinque subunità: α 2 ββ ω.

2 Il fattore sigma ha il ruolo di riconoscere il promotore. Le subunità α sono necessarie per assemblare il core dell enzima e per indebolire il legame al DNA. Le subunità β e β catalizzano i legami covalenti tra ribonucleotidi adiacenti. La subunità ω è importante per l assemblaggio corretto del core dell enzima. C10. Il fattore sigma può scorrere lungo il solco maggiore del DNA. In questo modo, riesce a riconoscere le sequenze esposte nel solco. Quando incontra un promotore, il legame idrogeno tra le basi e il fattore sigma può promuovere una interazione salda e specifica. C11. La mutazione altererebbe le basi in modo che i legami idrogeno con il fattore sigma non potrebbero avvenire del tutto oppure avverrebbero in maniera scorretta. Se guardiamo alla regione - 35 della Figura 12.4 ci possiamo attendere che cambiando i primi due nucleotidi in qualunque modo eccetto T la trascrizione sarebbe inibita. Lo stesso cambiando la terza base in A e la quarta in G o T e l ultima in qualunque modo tranne A. C12. DNA-G/RNA-C DNA-C/RNA-G DNA-A/RNA-U DNA-T/RNA-A Il filamento stampo è: 3' CCGTACGTAATGCCGTAGTGTGATCCCTAG 5' e il filamento codificante è: 5' GGCATGCATTACGGCATCACACTAGGGATC 3'. Il promotore si trova alla sinistra del filamento stampo (nella direzione 3 ). C13. La polimerasi scorre lungo il DNA e forma il complesso aperto, poi si muove. Il complesso aperto è una bolla di circa 17 bp. Dentro il complesso aperto il filamento di DNA che corre in direzione 3 5 viene usato come stampo la sintesi di RNA. Ciò avviene perché singoli nucleotidi si legano allo stampo secondo le regole descritte nella precedente risposta. Fintanto che l RNA polimerasi scorre in avanti, alle spalle del complesso il DNA si riassocia in doppia elica. C14. La terminazione della trascrizione avviene quando vengono rotti i legami idrogeno tra DNA e la parte dell RNA neosintetizzato che si trova nel complesso aperto. C15. Nella terminazione dipendente da rho la proteina ρ si lega al sito rut del trascritto subito dopo che si è formato. La sequenza di RNA forma una struttura ad ansa che induce il blocco dell RNA polimerasi. Dopo questa fermata la proteina ρ, che funziona da elicasi, rompe i legami idrogeno tra DNA e RNA all interno del complesso aperto, e allontana l RNA polimerasi e il trascritto completo. Nella terminazione indipendente da rho non serve alcuna proteina. L RNA forma una forcina che blocca l RNA polimerasi. Durante questa fermata una regione ricca in uracile si lega allo stampo nel complesso aperto. Questo legame è piuttosto instabile, perché i legami idrogeno sono limitati. In questo modo la molecola si dissocia dal complesso aperto e la trascrizione termina. C16. La DNA elicasi e la proteina ρ legano un filamento dell acido nucleico e si muovono in direzione 5 3. Quando incontrano una regione a doppio filamento rompono i legami idrogeno tra i filamenti complementari. La proteina ρ differisce dalla DNA elicasi in quanto la prima scorre sull RNA, la seconda lungo un filamento di DNA. La funzione della DNA elicasi è di promuovere la replicazione del DNA, quella della proteina ρ di promuovere la terminazione della trascrizione. C17. Le somiglianze tra RNA e DNA polimerasi sono le seguenti: 1. Usano entrambe un filamento stampo.

3 2. Sintetizzano entrambe in direzione La sintesi avviene in modo analogo in quanto sono usati dei nucleosidi trifosfati e vengono prodotti dei legami fosfodiesterici tra il nucleotide precedente e quello da inserire. 4. Sono entrambi enzimi processivi che scorrono lungo il filamento stampo di DNA. C18. A. Le mutazioni che alterano la regione ricca in uracile intoducendo guanine e citosine, e le mutazioni che prevengono la formazione della struttura a forcina. B. Le mutazioni che alterano la sequenza di terminazione e le mutazioni che alterano il sito rut. C. Alla fine a valle del gene verrà trovata qualche sequenza di terminazione e la trascrizione terminerà. Questo secondo terminatore può trovarsi in una posizione casuale oppure al termine di un gene adiacente. C19. A. RNA ribosomale (5,8S, 18S, e 28S). B. Tutti gli mrna e alcuni geni per snrna. C. Tutti i geni trna e quelli dell rrna 5S. C20. Il profilo degli elementi di regolazione dei promotori eucariotici è variabile. Nel caso dei geni strutturali trascritti dall RNA polimerasi II, è comune avere un TATA box circa 25 bp a monte del sito di inizio. Il TATA box è importante per l identificazione del sito di inizio della trascrizione e per assemblare l RNA polimerasi con i vari fattori di trascrizione. Il sito di inizio definisce il punto in cui viene avviata la trascrizione. C21. A. L RNA polimerasi non si sarebbe legata al promotore centrale. B. TFIID contiene la proteina che si lega al TATA box. Se questo fattore fosse assente, l RNA polimerasi non si legherebbe al TATA box. C. La formazione del complesso aperto non potrebbe avvenire. C22. Principalmente si tratta di un problema di accessibilità. Quando il DNA è saldamente avvolto agli istoni, per le grandi proteine quali l RNA polimerasi e i fattori di trascrizione diventa difficile riconoscere la corretta sequenza nucleotidica nel DNA e catalizzare il movimento del complesso aperto. Si ritiene che perché avvenga la trascrizione sia necessario un rilassamento del nucleosoma oppure la sua totale disaggregazione. C23. TFIID e TFIIB avrebbero ruoli equivalenti al fattore sigma. Il fattore sigma svolge due azioni: riconosce il promotore (come fa TFIID) e recluta l RNA polimerasi al promotore (come fa TFIIB). C24. Il legame idrogeno è un interazione predominante quando proteine e DNA seguono un processo di assemblaggio e disassemblaggio. Inoltre, possono avvenire legami ionici e interazioni idrofobiche. Non possono avvenire interazioni covalenti. Temperature elevate e elevate concentrazioni saline tendono a rompere i legami idrogeno. Perciò queste condizioni inibirebbero l assemblaggio e favorirebbero il disassemblaggio. C25. Sarebbe rimosso soltanto il primo introne. L RNA maturo sarebbe: esone 1 esone 2 introne 2 esone 3. C26. Nei batteri, l estremità al 5 del trna viene tagliata dall enzima RNasi P. L estremità al 3 viene tagliata da un endonucleasi diversa, e poi alcuni nucleotidi sono digeriti da un esonucleasi che li rimuove fino a raggiungere una sequenza CCA.

4 C27. Lo spliceosoma è composto da molte subunità chiamate snrnp, che contengono snrna e proteine. La funzione dello spliceosoma è di tagliare l RNA in due posizioni, tenere insieme le estremità, e poi catalizzare la formazione del legame covalente tra le due estremità. Durante questo processo, piccole molecole di snrna potrebbero essere coinvolte nel legame del pre-rna e/o potrebbero avere un ruolo catalitico, come l RNA della RNasi P. C28. Un ribozima è un enzima la cui parte catalitica è costituita da RNA. Ne sono esempio RNasiP e gli introni di gruppo I e II. Si ritiene che anche lo spliceosoma contenga dell RNA catalitico. C29. Un gene è colineare quando la sequenza nucleotidica del filamento codificante del DNA (ossia il filamento complementare allo stampo della sintesi di RNA) e la sequenza dell mrna sono identiche. La maggior parte dei geni procariotici e molti geni eucariotici sono colineari. Perciò puoi controllare la sequenza del gene nel DNA e predire la sequenza aminoacidica del polipeptide. Molti geni eucariotici però non sono colineari, essi contengono introni che vengono rimossi dal premrna. C30. Autosplicing significa che una molecola di RNA può maturare se stessa senza il coinvolgimento di proteine. Gli introni di gruppo I e II possono effettuare l autosplicing, sebbene delle proteine possano migliorare la velocità del processo. C31. Negli eucarioti il pre-mrna può subire la formazione del cappuccio, della coda, essere sottoposto allo splicing, all editing, e infine esportato nel nucleo. C32. Nello splicing alternativo avvengono delle variazioni del profilo di rimozione di sequenze, tale per cui gli mrna conterranno diverse combinazioni esoniche. Il significato biologico è che un solo gene potrà produrre più di una proteina, rendendo più efficiente l utilizzo del materiale genetico. Negli organismi pluricellulari lo splicing alternativo è un processo specifico del tipo cellulare. C33. Non si tratta di splicing perché non avviene la ligazione dei frammenti maturi dopo il taglio del trascritto primario. C34. Come si vede nella parte sinistra della Figura 12.15, la guanosina che si lega al sito di legame per la guanosina non possiede un gruppo fosfato. Questo nucleoside si avvolge al 5 dell introne. Perciò l introne non avrà un gruppo fosfato alla sua estremità 5. C35. A. U1 e U4/U6 B. U5 C. U2 C36. U5 C37. La sequenza di 60 nucleotidi si troverebbe nell ansa chiusa, che è la regione tra il sito di splicing al 5 e il sito di ramificazione. Domande sperimentali S1. La posizione dell introne nel cdna è mostrata qui sotto. cdna: 5 -ATTGCATCCAGCGTATACTATCTCGGGCCCAATTAATGCCAGC GGCCAGACTATCACCCAACTCG...INTRONE...GTTACCTACTAGTATATCCCATATA CTAGCATATATTTTACCCATAATTTGTGTGTGGGTATACAGTATAATCATATA 3

5 Lo puoi dedurre verificando in che punto la sequenza del DNA genomico diverge da quella del cdna. Il DNA genomico ha i normali siti di splicing descritti nella Figura DNA genomico: 5 ATTGCATCCAGCGTATACTATCTCGGGCCCAATTAATGCCAGCGGCCAGACTAT CACCCAACTCGGCCCACCCCCCAGGTTTACACAGTCATACCATACATACAAAA ATCGCAGTTACTTATCCCAAAAAAACCTAGATACCCCACATACTATTAACTCTT TCTTTCTAGTTACCTACTAGTATATCCCATATACTAGCATATATTTTACCCATAA TTTGTGTGTGGGTATACAGTATAATCATATA 3 I siti di splicing donatore e accettore sono sottolineati, così come il sito di ramificazione. La A in grassetto è quella che partecipa alla reazione di splicing. S2. Un ansa R è un ansa che si forma quando l RNA viene ibridato con la doppia elica di DNA. Se l RNA forma legami idrogeno con il filamento di DNA l altra elica, che non ha un filamento complementare con cui legarsi, formerà un ansa di estroflessione. L RNA è complementare al filamento stampo, per cui si lega a esso. S3. Introne Introne Introne RNA S4. La banda di 1100 nucleotidi si osserva nel caso del soggetto normale (corsia 1). La delezione che rimuove la regione tra 50 e 100 diminuisce notevolmente la trascrizione, per cui l omozigote produrrà poco o niente trascritto (solo una banda debole, come si vede nella corsia 2). L eterozigote produrrà metà del trascritto dell individuo normale. Il codone di stop non avrà effetti sulla trascrizione ma solo sulla traduzione, per cui la quantità di trascritto della corsia 4 è quella normale. Una mutazione che rimuove il sito accettore di splicing impedisce il processo, per cui l individuo produrrà un trascritto di 1550 nucleotidi circa. Il Northern blot è mostrato di seguito: S5. Quando il frammento di 900 bp viene mescolato con TFIID (corsia 1) la sua migrazione sarebbe ritardata perché TFIID si lega al DNA. Se mescolato con TFIIB (corsia 2) la migrazione non sarebbe ritardata perché TFIIB non può legarsi al DNA senza TFIID. In confronto alla corsia 1 il frammento di 900 bp sarebbe ulteriormente ritardato se mescolato con TFIID e TFIIB (corsia 3)

6 perché entrambi i fattori di trascrizione si legano al DNA. Non sarebbe ritardato quando mescolato a TFIIB e RNA polimerasi (corsia 4), perché manca TFIID che è necessario per il legame delle altre proteine. Infine, se mescolato con TFIID, TFIIB e RNA polimerasi/tfiif, il frammento di 900 bp migrerebbe con grande ritardo perché tutti i quattro fattori risulterebbero legati al DNA (corsia 5). S6. A. Non sarebbe ritardato perchè la proteina ρ non legherebbe l mrna codificato da un gene che viene terminato in maniera indipendente da rho. B. Sarebbe ritardato perché la proteina si legherebbe all mrna. C. Sarebbe ritardato perché U1 si legherebbe al pre-mrna. D. Non sarebbe ritardato perché U1 non si lega a un mrna che ha già rimosso gli introni, ma solo a un pre-mrna S7. A. La regione del gel che dovrebbe comprendere frammenti da 250 a 75 bp non contiene bande. Questa è la regione protetta, ed è lunga 175 coppie di basi. B. In un nucleosoma il DNA è avvolto due volte attorno al core istonico; un nucleosoma contiene 146 bp di DNA. La regione legata a RNA polimerasi/tfiid/tfiib sarebbe di poco più lunga. Perciò, queste proteine avrebbero ricoperto un nucleosoma nel quale era contenuto il DNA. E difficile immaginare (anche se possibile) che proteine grandi quali TFIID, TFIIB e RNA polimerasi II si siano trovate tutte attorno a un solo nucleosoma. Perciò questi risultati indicano più probabilmente che il DNA sia stato rilasciato dal core istonico mentre legato ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi. S8. A. Una molecola di mrna si legherebbe alla colonna perché possiede la coda di polia, La sequenza di adenine nella coda è complementare alla stringa di timine nella colonna poli-dt, per cui si formano dei legami idrogeno tra loro. Per purificare gli mrna si inizia con un campione di cellule. Esse vengono rotte tramite omogeneizzazione o sonicazione, in modo da rilasciare le macromolecole tra cui gli RNA. Le grandi strutture cellulari come organelli, membrane, ecc, possono essere rimosse mediante un passaggio di centrifugazione, che lascerebbe nel pellet le strutture cellulari e nel sovranatante le molecole solubili. A questo punto usi concentrazioni saline elevate e ph neutrale e versi il sovranatante nella colonna di poli-dt. Gli mrna si legheranno alla colonna, mentre le altre molecole non lo fanno. Infine per rompere i legami idrogeno che legano gli mrna alla colonna aggiungi una soluzione con bassa concentrazione salina e/o ph basico. B. La strategia di base è di aggiungere alla matrice della colonna una stringa di nucleotidi complementare al tipo di RNA che desideri purificare. Per esempio se il tuo RNA contiene la sequenza 5' AUUCCUCCA 3' puoi sintetizzare un oligonucleotide 3' TAAGGAGGT 5' e attaccarlo alla colonna. Per purificare l RNA segui la strategia descritta in A.