BIOTECNOLOGIE. Date fondamentali:

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1 BIOTECNOLOGIE Con il termine generico di biotecnologia (tecnologia biologica) si indicano tutte le applicazioni tecnologiche della biologia. Tra le definizioni disponibili, la più completa è senza dubbio quella stesa dalla Convenzione sulla Diversità Biologica, ossia: "La biotecnologia è l'applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, degli organismi viventi o di derivati di questi per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico". La biotecnologia, quindi, può essere definita come quel ramo della biologia riguardante l'utilizzo di esseri viventi al fine di ottenere beni o servizi. Nel linguaggio corrente, si utilizza più frequentemente il termine al plurale (biotecnologie), ad indicare la pluralità di tecnologie sviluppate e i campi di applicazione interessati. Già nell antichità possiamo trovare alcune forme di biotecnologia, utili ad ottimizzare il ruolo dei microrganismi. Basta pensare all uso dei batteri lattici e lieviti per ottenere la lievitazione del pane, al caglio per produrre il formaggio o ai processi fermentativi di birra e vino. Ci sono due scuole di pensiero su cosa sia la biotecnologia. Entrambi usano gli organismi per aiutare l uomo. La biotecnologia moderna maneggia i geni degli organismi e li inserisce in altri organismi per acquistare la caratteristica voluta, la biotecnologia tradizionale usa invece i processi degli organismi, come per esempio la fermentazione. Le seguenti tecnologie permettono l utilizzo delle conoscenze biologiche: codificazione del DNA: genomica, farmacogenetica, test genetici, amplificazione, sintesi e sequenziazione del DNA, ingegneria genetica. Sintesi e sequenziazione di proteine e peptidi(i blocchi funzionali), glyco-engineering, proteomica, ormoni e fattori della crescita, recettori delle cellule, comunicazione delle cellule e feromoni. Ingegneria delle cellule e dei tessuti: cultura delle cellule e dei tessuti, ingegneria dei tessuti, ibridazione, fusione cellulare, vaccini e immunostimulatori, manipolazione embrionale. Biotecnologie di processo: bioreattori, fermentazione, processi biotecnologici produttivi, estrazione metalli con batteri, biocatalizzatori nella fabbricazione della carta, biodesulfurazione, decontaminazione del suolo e biofiltrazione. Terapia genetica e vettori virali. Date fondamentali: 1750 AC.- I Sumeri fermentano la birra. 500 AC.- I cinesi usano la soia come antibiotico per trattare malattie della pelle Janssen inventa il microscopio Leeuwenhoek scopre i protozoi ed i batteri Jenner inietta ad un bambino un vaccino virale per proteggerlo dalla vaiolo Vengono scoperte le proteine Viene scoperto il nucleo delle cellule Pasteur comincia a lavorare il lievito, provando per la prima volta che si tratta di organismi viventi Mendel, nel suo studio sui piselli, scopre che le caratteristiche sono state trasmesse dai genitori alla progenie da unità indipendenti, denominate successivamente geni. Le sue osservazioni pongono le fondamenta nel campo della genetica Fleming scopre le cromatine, le strutture ad asta all'interno del nucleo delle cellule che successivamente vengono chiamate "cromosomi." Waldyer scopre il cromosoma E segnalata la prima coltura in vivo delle cellule animali Alcuni geni vengono collegati alle malattie ereditari Viene scoperto il primo virus che causa il cancro.

2 La parola "biotecnologia" viene usata per la prima volta da un assistente tecnico agricolo ungherese Evans e Long scoprono l ormone della crescita Fleming scopre la penicillina, il primo antibiotico Watson e Crick rivelano la struttura tridimensionale del DNA Viene isolato per la prima volta un enzima addetto alla sintesi di un acido nucleico Per la prima volta viene compreso il codice genetico Viene per la prima volta sintetizzato in vitro un enzima La composizione del DNA degli esseri umani viene scoperto essere per il 99% simile a quelle degli scimpanzé Cohen e Boyer effettuano il primo esperimento ricombinante del DNA, usando geni dei batteri Batteri geneticamente costruiti vengono utilizzati per sintetizzare la proteina umana della crescita Vengono prodotti i primi anticorpi monoclonali Humulin, l'insulina umana prodotta dalla Genentech, utilizzando batteri geneticamente modificati, è il primo farmaco biotech che viene approvato dalla FDA per il trattamento del diabete Viene sviluppata la tecnica dell impronta genetica del DNA. Viene sviluppato il primo vaccino geneticamente modificato Humatrope viene usato per curare la deficienza del fattore di crescita Il Congresso USA costituisce un fondo per il progetto del genoma umano allo scopo di tracciare ed ordinare il codice genetico umano Epogen della Amgen è approvato per il trattamento dell'anemia collegata a malattie renali Betaseron della Chiron è approvato come il primo trattamento per la sclerosi multipla Scienziati scozzesi clonano la pecora Dolly, usando il DNA di cellule di pecore adulte. La pelle umana viene prodotta in vitro Viene decifrato il codice genetico completo del cromosoma umano Viene pubblicata la sequenza del genoma umano, che permette ai ricercatori di tutto il mondo di cominciare a sviluppare nuove cure per malattie finora incurabili Viene approvato l Avastin della Genentech, primo farmaco anti-angiogenesi per il trattamento del cancro al colon Vengono ottenute le prime cellule staminali embrionali senza utilizzare embrioni, risolvendo importanti questioni etiche. La Scoperta dei microrganismi: nascita delle biotecnologie innovative Pasteur tra il 1857 e il 1876 comprende la produzione della birra e i microrganismi che la permettono. Per questo viene considerato il padre della biotecnologia. Inoltre, individua i batteri responsabili della fermentazione del latte e del burro, i microbi responsabili delle alterazioni della birra e del vino. Pasteur crea un vaccino per la rabbia, selezionando dei mutanti del virus della rabbia che hanno perso la virulenza rispetto all'uomo. Questa è una tecnica che anticipa la biotecnologia moderna basata sull'ingegneria genetica. Nel 1878 vengono scoperti i componenti delle cellule di lievito e vengono chiamati "enzimi". La scoperta degli antibiotici Fleming, con la scoperta della Penicillina, da inizio ad un nuovo tipo di medicinali: gli antibiotici. In seguito ne vennero scoperti molti altri tipi. La possibilità di produrre tutti questi antibiotici su scala industriale è legata alla selezione di specie capaci di produrre sostanze in quantità maggiori rispetto alla specie trovata in natura. Nascita dell'ingegneria genetica Griffith è il padre dell ingegneria genetica. Si deve a lui la scoperta che i batteri, attraverso un processo definito trasformazione batterica, possono acquisire, riconoscere e mantenere materiale ereditario esterno, derivante da altri batteri. Egli non sapeva che il materiale ereditario era costituito da DNA. Saranno Avery, MacLeod e McCarthy nel 1944 a fare tale scoperta. Nel 1953 Watson e Crick scoprono il modo di duplicarsi del DNA.

3 L avvento delle tecnologie del DNA ricombinante o ingegneria genetica segna una linea di demarcazione fra biotecnologie tradizionali e biotecnologie innovative, caratterizzate dal cambiamento mirato di attività di organismi ottenute modificandone il patrimonio genetico. Questo porta alle innumerevoli scoperte recenti: le piante transgeniche, gli animali modificati, la clonazione (prima con la pecora Dolly - vedi figura - e poi in seguito persino con una mucca, e negli ultimi tempi anche quella umana), la mappatura del genoma umano. Queste nuove applicazioni hanno portato a problemi etici, altri riguardanti la biodiversità, l'uso dei cibi transgenici Cos'è l'ingegneria GENETICA? L unione dei termini Ingegneria e Genetica sta ad indicare un atteggiamento progettuale (ingegneria), rivolto verso il patrimonio genetico di un organismo vivente. La Biotecnologia avanzata (che si impegna a creare nuovi organismi a partire dal trasferimento di geni da un organismo ad un altro), si avvale dell Ingegneria genetica. Quest ultima nacque circa vent anni fa, fondendo competenze di genetica e di biologia molecolare. Basilare la scoperta della struttura del DNA (acido desossiribonucleico) da parte di James Watson e Francis Crick nel 1953 e la scoperta di D.T. Avery negli anni 40, riguardante il DNA come la sostanza in cui risiedono tutte le informazioni genetiche. Il trasferimento dei geni, unità che permettono l ereditarietà di determinate caratteristiche da una specie ad un altra, avviene grazie alla struttura in comune del DNA: una doppia elica composta da molecole di zucchero e di fosfato. Tuttavia, i geni operano spesso in gruppi che cooperano alla definizione di una o più caratteristiche dell organismo. Per questo motivo, non si verifica una mescolanza casuale ma occorre individuare le funzioni di ogni specifico gene e la comprensione delle sue interazioni con gli altri geni sia dell organismo donatore, sia del ricevente. Grazie alle nuove caratteristiche genetiche, un entità vivente può trasformarsi esteriormente o acquisire proprietà produttive nuove, come nel caso dell elaborazione di proteine utili all uomo da parte di batteri. Tecnologie del DNA RICOMBINANTE complesso insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare dei brevi segmenti di tale molecola, per moltiplicarli, studiarne la sequenza nucleotidica, trasferirli nel genoma di altre cellule controllandone l incorporazione e l espressione. Tappe necessarie sono: Avere segmenti abbastanza piccoli da essere analizzati e manipolati Avere grosse quantità di questi piccoli segmenti Conoscere la sequenza nucleotidica di questi segmenti Essere in grado d identificare i segmenti specifici presi in considerazione Come ottenere brevi segmenti di DNA Nei batteri sono presenti degli enzimi, detti enzimi di restrizione, che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti, prima che vengano duplicati o trascritti. Il taglio è effettuato presso sequenze nucleotidiche specifiche, dette di riconoscimento. I batteri producono questi enzimi, per proteggersi dall aggressione dei virus batteriofagi. Esistono due tipi di enzimi: 1. alcuni tagliano di netto la molecola di DNA 2. altri tagliano la molecola di DNA con lo scarto di alcuni nucleotidi, detti estremità coesive ( o appiccicose ). Queste possono unirsi ad un altra molecola di DNA (con estremità coesiva complementare) tagliata dallo stesso enzima di restrizione, mediante l enzima DNA-ligasi. Brevi segmenti di DNA si possono ottenere in due modi: 1. attraverso gli enzimi di restrizione;

4 2. attraverso l enzima trascrittasi inversa (catalizza la trascrizione dell mrna in DNA). Dopo che è avvenuta la sintesi di un filamento singolo di DNA, il filamento di RNA messaggero viene eliminato. Infine si assembla il secondo filamento di DNA, usando il primo come stampo. 3. Se invece è nota la sequenza di DNA, si possono sintetizzare segmenti di esso in laboratorio mediante mezzi chimici. Come ottenere copie multiple Per avere un numero elevato di segmenti di DNA identici si possono utilizzare due tipi di tecniche: Clonazione del DNA I dispositivi per duplicare i brevi segmenti di DNA sono i batteri; il più utilizzato tra questi è E. Coli poiché le conoscenze su di lui sono molto più specifiche, che su qualunque altro essere vivente. Ciò di cui si ha bisogno sono dei vettori (plasmidi e virus), che possano trasportare i segmenti di DNA da moltiplicare nelle cellule batteriche. Si opera in questo modo: 1. si isola il DNA che si vuole prendere in esame e un plasmide; 2. si tagliano entrambi con lo stesso enzima di restrizione che crea estremità coesive sia nel DNA che nel plasmide; 3. il segmento di DNA è mescolato con il plasmide tagliato. Le basi azotate delle estremità coesive del plasmide si appaiano con quelle delle estremità complementari del frammento di DNA in analisi; 4. l enzima DNA-ligasi unisce mediante legami covalenti le due molecole di DNA. Questo plasmide è inserito in un batterio, dove assieme al DNA estraneo, che esso porta con se, inizia a duplicarsi, producendo quantità enormi di copie. Tali copie multiple sono dette cloni. Questo metodo ha il vantaggio di produrre grandi quantità di sostanze in poco tempo. Reazione a catena della polimerasi (PCR) Questo processo è stato messo a punto nel 1989 ed è in grado a partire da un piccolissimo campione di DNA, in poche ore, di sintetizzare milioni di copie di uno specifico segmento di DNA. Pertanto risulta più rapido rispetto alla clonazione del DNA e differentemente da questa necessita della conoscenza delle sequenze nucleotidiche di ciascuna estremità del segmento di DNA che si vuole copiare. In campo medico questa tecnica è usata per la diagnosi prenatale delle malattie genetiche e per la ricerca d infezioni causate da virus latenti (AIDS). Il processo si svolge in questo modo: 1. Il campione di DNA è posto in una soluzione contenente molecole di DNA-polimerasi (enzimi usati per la duplicazione del DNA) ed un numero sufficiente di nucleotidi (molecole innesco di DNA). 2. Nella miscela il DNA si duplica dando luogo a due nuovi filamenti identici; queste molecole, a loro volta, si duplicano e il processo continua finché si trovano nucleotidi a disposizione. Ad ogni duplicazione la quantità di DNA raddoppia. Come determinare le sequenze nucleotidiche I sistemi di sequenziazione del DNA: elettroforesi reazioni chimiche o enzimatiche Campioni identici di una molecola di DNA da sequenziare vengono trattati con differenti enzimi di restrizione che tagliano il DNA in siti differenti. I frammenti di ciascun gruppo sono separati tra loro, clonati ed analizzati. In questo modo si determinano le sequenze nucleotidiche di ciascun frammento.

5 I frammenti prodotti dai due enzimi di restrizione si sovrappongono ed è possibile determinare la sequenza nucleotidica dell intera molecola. Come identificare i segmenti specifici di DNA Ibridazione L ibridazione rappresenta uno dei metodi per individuare ed isolare i segmenti specifici di DNA e si basa sulla proprietà di appaiarsi tipica delle basi azotate degli acidi nucleici. Processo di ibridazione: 1. si mescolano molecole di DNA di diversa provenienza, in una soluzione; 2. si scalda il tutto provocando la rottura dei legami ad idrogeno, che uniscono i due filamenti; 3. lasciando raffreddare, i ponti ad idrogeno tendono a ristabilirsi e i filamenti possono riappaiarsi con altri filamenti dalla sequenza genetica quasi completamente ; una volta che si sono riformati i ponti a idrogeno abbiamo ottenuto delle doppie eliche ibride. Sonde Per individuare i segmenti ibridi specifici si ricorre all uso di sonde (mrna, sequenze di DNA o segmenti di DNA sintetici), che cerchino segmenti di DNA o RNA con una sequenza complementare. Si prende un isotopo radioattivo e lo si inserisce in un breve segmento di DNA o RNA a filamento singolo,che deve avere la sequenza complementare a quella cercata; la sonda può anche essere marcata con un colorante fluorescente. Altri marcatori genetici sono i RFLP: la loro esistenza è dovuta al fatto che variazioni ereditarie, o mutazioni, portano a lunghezze differenti dei frammenti prodotti dagli enzimi di restrizione. Come cambia la RICERCA? La biotecnologia è la scienza di questo secolo. I suoi progressi hanno segnato la prima tappa fondamentale di un grande viaggio. Dopo aver esplorato lo spazio e gli abissi degli oceani, oggi gli strumenti scientifici e le tecniche moderne ci permettono di analizzare l'universo degli atomi. La biotecnologia sta utilizzando le scienze della biologia, della chimica, e della fisica, l'ingegneria, i calcolatori e la tecnologia dell'informazione per sviluppare gli strumenti ed i prodotti che si rivelano una grande promessa, ma anche una grande sfida. La Biotecnologia moderna è destinata a rivoluzionare ampi settori del mondo, analogamente a come è stato molti anni fa con lo sviluppo della chimica. La portata dei cambiamenti in arrivo spazia dalla produzione industriale alla produzione agricola, dalle problematiche ambientali, al mondo della salute. In quest ultimo settore, i cambiamenti sono senza dubbio i più rilevanti. E mutato il modo di fare ricerca di nuovi farmaci e gli stessi farmaci sono diversi rispetto al passato. Con la biotecnologia, i ricercatori si avvalgono della comprensione dei meccanismi biologici che governano una determinata malattia e delle banche dati genetiche, per individuare molto più rapidamente molecole efficaci per trattare altri disturbi. Se tests e sperimentazioni hanno tempi analoghi a quelli del passato, l individuazione di nuove molecole candidate è velocizzata, con un incremento nella produzione di nuovi e più efficaci farmaci, di cui già diversi sono sul mercato. I nuovi farmaci biotecnologici, inoltre, sono più precisi e più mirati perché basati su una maggiore conoscenza dell organismo. Quali sono i principali VANTAGGI PER L'UOMO? Le biotecnologie consentono di proteggere in maniera più efficace la nostra salute, grazie ai nuovi farmaci sviluppati: vaccini più sicuri, medicinali contro disfunzioni metaboliche a base genetica prima incurabili, trattamenti contro diverse forme di epatite, antitumorali più efficaci e meno dannosi per l organismo, stimolatori delle difese immunitarie in caso di loro abbassamento e regolatori delle stesse in caso di funzionamento eccessivo. Tali trattamenti hanno migliorato sostanzialmente le aspettative dei malati di HIV/AIDS.

6 L insulina umana prodotta mediante ingegneria genetica è stata il primo farmaco biotecnologico ad essere immesso sul mercato. Essa è una proteina prodotta nel pancreas: essenziale per la regolazione del metabolismo dei carboidrati e per la cura del diabete. Poiché la sua struttura è simile in molti mammiferi, è stato possibile trattare il diabete somministrando tale ormone estratto dal pancreas bovino o suino. Tale processo, tuttavia, è risultato complesso e costoso. Per questo è stato clonato il gene dell insulina umana. Altre importanti innovazioni portate dalla biotecnologia sono la mappatura del genoma umano (ovvero del nostro intero patrimonio genetico), nuovi tests diagnostici (ad esempio il prenatale, praticato sull embrione per svelare anomalie genetiche) e loro rapide versioni. Non dobbiamo dimenticare che oggi vi sono grandi prospettive per l applicazione della biotecnologia alla soluzione di molti problemi ambientali: controllo dell inquinamento, eliminazione dei rifiuti tossici, recupero dei metalli dalle scorie minerarie e dai minerali a basso tenore, grazie all azione di geni utili per la biodegradazione di composti chimici tossici. Molte sono, inoltre, le varietà vegetali modificate con l ingegneria genetica dette O.G.M. (organismi geneticamente modificati) al fine di migliorarne le qualità nutrizionali (latte particolarmente ricco di sostanze proteiche, riso arricchito di vitamina A ed E), la resistenza alle malattie, la produttività e la tolleranza ai fattori nocivi. BIOETICA Affascinati dalle potenzialità della biotecnologia ma avendone spesso solo una comprensione semplificata e meccanica, i media spesso trattano l argomento annunciandone talvolta i risvolti più d effetto: applicazioni impossibili o probabili rischi. Ciò ha sollevato l esigenza di riflettere sui vincoli e i confini da porre all applicazione della biotecnologia e ha portato alla nascita di una specifica area di discussione chiamata Bioetica. Con la crescita della biotecnologia in molti settori, si è ritenuto necessario formulare delle norme atte a regolamentare i problemi posti dalle innovazioni scientifiche (in particolare la liceità degli esperimenti). Tutti sembrano concordi nell accettare la produzione di animali transgenici per sperimentazioni nelle cure di certe malattie, l utilizzo di materiale genetico per produrre farmaci o vaccini. La raccomandazione del Consiglio d Europa numero 1046 del 24/09/1986 chiede ai governi di proibire: la creazione di embrioni umani in vitro per scopi di ricerca, la clonazione umana, lo scambio di geni tra uomini e animali. L industria delle biotecnologie europea ha raccolto in un codice una summa di valori approvati a Bruxelles nel Essi sono condivisi e applicati da 14 associazioni nazionali rappresentative di 50 gruppi imprenditoriali.