PARETE DEI GRAM+ E GRAM -

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1 PARETE DEI GRAM+ E GRAM - Esistono importanti differenze sia di struttura che di composizione chimica tra Gram+ e Gram- Gram + Gram -

2 STRUTTURA COMPLESSIVA DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM - Complessa ultrastruttura e composizione; Componenti non mureinici organizzati a formare una MEMBRANA ESTERNA O PARIETALE: Struttura: in due foglietti tipica di tutte le membrane biologiche; Composizione: FOSFOLIPIDI: simili a quelli della membrana citoplasmatica, situati nel foglietto interno. LIPOPOLISACCARIDE: costituisce con la sua componente lipidica la maggior parte del foglietto esterno. PROTEINE: inserite a varie altezze. LIPOPROTEINA: ancora la membrana esterna allo strato sottostante di peptidiglicano.

3 STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE (LPS) Unità di ripetizione Outer core Inner core CATENA LATERALE O CORE LIPIDE A Polisaccaride Lipide Lipopolisaccaride

4 POSIZIONE DEL LPS NELLA MEMBRANA ESTERNA Occupa la maggior parte del foglietto esterno della membrana esterna; la porzione polisaccaridica è rivolta verso l esterno, il lipide A è immerso nello spessore della membrana

5 CATENA LATERALE O LIPOPOLISACCARIDE (LPS) Polimero di unità oligosaccaridiche di ripetizione (in media 40 unità); Trisaccaride lineare o tetra, penta saccaride ramificato; Almeno 20 diversi tipi di zuccheri molti dei quali sono dei dideossiesosi che si ritrovano, in natura, solo nella parete dei batteri Gram-; Legionella pneumophila, serogruppo 1: omopolimero formato da circa 75 residui di un solo zucchero; Rappresenta la parte più variabile alla base della classificazione sierologica dei batteri Gram- CORE E' un oligosaccaride costante nell'ambito di un genere; L' inner core di tutti i batteri Gram- contiene uno zucchero a 8 atomi di C (2-keto-3-deoxyoctulosio) più, in tutte le Enterobacteriaceae, è presente uno zucchero a 7 atomi di C. L'outer core è la porzione relativamente più variabile anche se vi sono presenti zuccheri a 6 atomi di C comuni. LIPIDE A E' un glicofosfolipide; Consiste in un dimero di NAG-fosforilata con legati acidi grassi a catena lunga; Rappresenta la porzione idrofobica che si ancora alla membrana esterna; Rappresenta il principio tossico dell'intera molecola; Altamente conservato in tutti batteri Gram-

6 FUNZIONI DELLA MEMBRANA ESTERNA E DELL' LPS barriera di permeabilità selettiva (ancor più selettiva della membrana interna) che si oppone al passaggio di molecole idrofobiche (dovuto alla catena laterale O, idrofilica, del LPS) e di molecole idrofiliche (dovuto al doppio strato fosfolipidico) al di sopra di certe dimensioni. LPS rappresenta una importante struttura di superficie nell'interazione dell'agente patogeno con il suo ospite: per es. può essere coinvolto nell'adesione (colonizzazione) e nella resistenza alla fagocitosi; è sede dei determinanti antigenici; se liberato in un ospite sensibile, dà luogo a numerosi effetti tossici (ENDOTOSSINA BATTERICA)

7 TOSSINE BATTERICHE: molecole con attività tossica nei confronti dell ospite; la produzione di tossine è uno dei meccanismi principali con cui i batteri causano le malattie (es: tetano, difterite, pertosse, colera) ENDOTOSSINE componenti strutturali; quasi sempre rilasciate in seguito a lisi ESOTOSSINE rilasciate nel mezzo esterno da cellule vitali

8 Proprietà Endotossine Esotossine Natura chimica Localizzazione in rapporto alla cellula batterica Sensibilità alla denaturazione termica Modalità di azione e sintomatologia Complessa: lipopolisaccaride (MW: c.a. 10 kda) Componenti della membrana esterna dei batteri Gram- Termostabili Non specifica; febbre, infiammazione Proteine (MW: c.a kDa) Secrete Termolabili Attività enzimatica Nessuna Di solito Tossicità Immunogenicità Relativamente poco potenti: LD 50 nel topo: µg/animale Relativamente poco immunogeniche: la risposta immunitaria non è sufficiente a neutralizzare la tossina Specifica; citotossine, enterotossine, neurotossine con azione specifica su cellule e tessuti Altamente tossiche, spesso fatali: LD 50 tossina botulinica nel topo: 25pg Altamente immunogeniche: stimolano la produzione di anticorpi neutralizzanti (antitossine) Potenzialità del tossoide Nessuna Il trattamento della tossina con formaldeide elimina la tossicità, ma non l'immunogenicità (tossoide) Attività piretica Spesso inducono febbre nell'ospite Non inducono febbre nell'ospite

9 EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA Le endotossine, inoculate in un animale a loro sensibile, danno luogo ad una vasta gamma di sintomi in conseguenza del loro effetto su diversi organi e sistemi. Qualsiasi apparato o cellula dell'organismo sembra rispondere sia in vitro che in vivo allo stimolo endotossico. Piccole dosi di endotossina Bersagli Monocitimacrofagi Neutrofili Linfociti B Complemento Attività Sintesi di IL-1 e TNF Rilascio amine vasoattive Attivazione Attivazione Effetti Febbre Vasodilatazione Produzione di anticorpi Infiammazione Alte dosi di endotossina Coagulazione intravasale Shock Alterazione della funzionalità di molti organi

10 L'ENDOTOSSINA DI SOLITO UN IMMUNOSTIMOLANTE TALVOLTA UNA "TOSSINA"

11 EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA SEMPLIFICATI 1) Effetto pirogeno (capacità di indurre febbre anche a basse dosi) LPS Macrofago IL-1 TNF-alfa Centro termoregolatore dell'ipotalamo 2) Attiva vari tipi cellulari -Macrofagi (aumento della fagocitosi e capacità battericida, produzione di monochine che agiscono su vari altri tipi cellulari e tessuti) -Linfociti B (proliferazione e differenziazione in plasmacellule) -Cellule endoteliali -Piastrine -Granulociti 3) Induce infiammazione 4) Induce vasodilatiazione con conseguente ipotensione e shock 5) Attiva il complemento 6) Stimola la coagulazione del sangue CID (coagulazione intravasale disseminata) Coagulazione Intravasale Disseminato A livello cutaneo visibili delle "petecchie" Consumo dei fattori della coagulazione e conseguente emorragie I coaguli a livello del microcircolo degli organi causano ischemia con conseguente insufficienza d organo

12 VISIONE D'INSIEME DEI MOLTEPLICI EFFETTI DELL'ENDOTOSSINA

13 RUOLO DELL'ENDOTOSSINA NELLO SHOCK ENDOTOSSICO Shock endotossico: grave quadro clinico che può accompagnare le setticemie da batteri Gram- caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria e nelle fasi finali da CID ed insufficienza d organo. Frequenza: 1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi; 20-30% nei reparti di terapia intensiva. Esito fatale: 40-60% dei pazienti, nonostante terapie antibiotiche.

14 METODI DI DOSAGGIO DELL'ENDOTOSSINA I LPS batterici per la loro diffusione ubiquitaria e per l'estrema stabilità ad agenti chimici e fisici rappresentano una frequente contaminazione ambientale NECESSITA' DI VERIFICARE LA PRESENZA DI ENDOTOSSINA IN PREPARAZIONI TERAPEUTICHE, PRODOTTI BIOLOGICI, REAGENTI TEST PIROGENO NEL CONIGLIO TEST DEL LILMULUS Sfrutta la capacità del lisato di amebociti (unici elementi cellulari) presenti nell'emolinfa di un crostaceo, il Limulus polyphemus, di gelificare anche in presenza di piccolissime quantità di endotossina (ng). Può essere utilizzato per rivelare la presenza di LPS nel liquor, nel plasma, nelle urine od in altri liquidi biologici, per una diagnosi rapida, anche se aspecifica di infezione da Gram-.

15 LE PROTEINE DELLA MEMBRANA ESTERNA DEI BATTERI GRAM - (50% della massa della membrana) Vengono indicate con la sigla Omp (outer membrane proteins) seguita da una lettera dell alfabeto o con sigle indicative della loro funzione; Sono di due tipi principali: PROTEINE PORINE PROTEINE STRUTTURALI Proteina A Lipoproteina LIPOPROTEINA: piccola proteina con funzione di ANCORAGGIO (strutturale); parte proteica, legata al peptidoglicano (tetrapeptide); parte lipidica, inserita nel foglietto interno della membrana esterna. PROTEINA A (OmpA): attraversa tutto il bilayer lipidico; funzione di STABILIZZAZIONE STRUTTURALE

16 PORINE: le più abbondanti c.a /cellula Peso Molecolare variabile (30-50 Kda); SONO TRANS-MEMBRANALI, ORGANIZZATE A FORMARE DEI TRIMERI (TRE SUBUNITA IDENTICHE) ciascuna delimitante un poro idrotata; SI OPPONGONO AL PASSAGGIO DELLE MOLECOLE IDROFOBICHE; SONO PERMEABILI ALLE MOLECOLE IDROFILICHE; SONO DEI FILTRI MOLECOLARI Due TIPI: - ASPECIFICHE: selezionano solo in base alle dimensioni della molecola (piccole molecole idrofiliche < 600 Da) o, al massimo, per la carica -anioni o cationi- - SPECIFICHE: permettono il passaggio di 1 solo soluto o di pochi soluti strutturalmente simili (molecole idrofiliche più grosse: zuccheri, vitamine ecc.es: LamB di E. coli, specifica per le maltodestrine)

17 FUNZIONI DELLE PORINE CANALI CHE PERMETTONO IL PASSAGGIO DI SOSTANZE IDROFILICHE ATTRAVERSO LA MEMBRANA ESTERNA RUOLO NELLA RESISTENZA AI FARMACI sostituzione di aminoacidi neutri con aminoacidi carichi che si proiettano all interno del poro e perturbano la normale diffusione degli antibiotici in presenza di antibiotici viene diminuita od eliminata l espressione delle porine implicate nella diffusione di quell antibiotico FUNZIONE DI RECETTORI per fagi per batteriocine per componenti del complemento per anticorpi FATTORI DI PATOGENICITA BATTERICA possono promuovere l invasione delle cellule dell ospite. l aderenza l attività citotossica. (vengono secrete in piccole vescicole che si fondono con la membrana delle c. eucariotiche)

18 Esempi di Omp di Gram-negativi Proteina OmpA e Murein-lipoproteina OmpB LamB (maltoporina) OmpC OmpF PhoeE TonB Tsx Funzione Entrambe stabilizzano la membrana Porina aspecifica Porina specifica per il maltosio e maltodestrine; recettore di l Porina aspecifica per piccole molecole recettore per il fagot4 Porina aspecifica per piccole molecole Porina specifica per anioni; viene INDOTTA da P i limitante Sideroporo per il transito del ferro e specifico per la Vit B 12 Porina specifica per i nucleosidi