Regolazione della trascrizione. Operoni catabolici nei procarioti (controllo negativo)

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1 Regolazione della trascrizione Operoni catabolici nei procarioti (controllo negativo)

2 I geni possono essere accesi e spenti In un organismo pluricellulare adulto, vi sono molti tipi di cellule differenti, ad esempio muscolari, nervose e del sangue. Tutti I tipi di cellule contengono lo stesso. La differenziazione deriva dal fatto che cellule diverse esprimono geni differenti.

3 Regolazione genica Che cosa accende o spegne un gene? Quando un gene viene acceso o spento? Dove(in quali cellule) viene acceso un gene? Quante copie del prodotto genico vengono sintetizzate?

4 In una cellula procariote, non tutti i geni sono attivi in ogni momento della vita cellulare. Partiamo da un esempio pratico e semplice: l utilizzazione dello zucchero lattosio da parte di una coltura di batteri Escherichia coli. I batteri traggono l energia per la produzione di ATP dalla glicolisi del glucosio. Se il glucosio non è disponibile, ma lo è il lattosio (disaccaride costituito da una molecola di glucosio ed una di galattosio, unite da un legame β-d-glicosidico) le cellule possono scinderlo grazie all azione dell enzima β -galattosidasi. Questa reazione può essere monitorata se invece del lattosio, in vitro, si utilizza un suo analogo che sviluppa una reazione cromogena in seguito alla scissione da parte della β -galattosidasi. + glucosio + lattosio N cellule/ml Attività della β-galattosidasi + lattosio + glucosio Tempo Cinetiche di crescita di E. coli in presenza di glucosio e di lattosio. Si può osservare un lieve ritardo di crescita quando le cellule crescono in solo lattosio. Tempo Attività dell enzima β-galattosidasi in estratti batterici preparati a tempi diversi in colture esposte a glucosio e a lattosio: l enzima è attivo solo nelle coltura cresciute in presenza di lattosio.

5 Come si può spiegare questo risultato? Ipotesi A: L enzima è già presente in entrambi i tipi di coltura, ma risulta essere attivo solo nei batteri coltivati in presenza di lattosio. Ipotesi B: La sintesi dell enzima viene indotta dalla presenza del lattosio nel terreno di coltura.

6 La difficoltà nel dare una risposta è legata al fatto che identifichiamo la β-galattosidasi sulla base della sua attività enzimatica, e non come proteina in quanto tale. Se iniettiamo la β-galattosidasi purificata in un animale da esperimento, possiamo ottenere anticorpi specifici che riconoscono l enzima in quanto proteina. β-galattosidasi Trasferimento delle proteine su nitrocellulosa e identificazione della β-galattosidasi con l anticorpo specifico iniezione Estratto di E. coli cresciuto in glucosio Estratto di E. coli cresciuto in lattosio +Gluc +Lac β-galattosidasi Prelievo di sangue Numerose proteine Antisiero anti-β-galattosidasi Conclusione:

7 La molecola della β-galattosidasi compare come tale, e non solo come attività enzimatica, quando le cellule vengono fatte crescere in presenza di lattosio, mentre non è praticamente presente in cellule che siano state fatte crescere in presenza di solo glucosio. Si deve quindi dedurre che il lattosio INDUCE la neointesi dell enzima che è responsabile della sua degradazione. In che modo si spiega questo effetto?

8 Lo studio di mutanti di E. coli alterati nell utilizzazione del lattosio ha portato Jacob e Monod a proporre un modello di regolazione genica nei procarioti. 1. Isolamento di diverse classi di mutanti di E. coli incapaci di crescere in presenza di lattosio (Lac - ) 2. Isolamento di diverse classi di mutanti Lac + con sintesi costitutiva di β-galattosidasi. 1. Mutanti Lac - Alcuni di questi mutanti producono una β-galattosidasi alterata, visibile come molecola ma non come attività enzimatica (mutanti strutturali). Altri sono totalmente incapaci di produrre β -galattosidasi, pur non avendo mutazioni nel gene (mutanti di regolazione). Altri ancora non hanno mutazioni a carico del gene β -gal, ma in altri geni strutturali vicini. 2. Mutanti Lac + costitutivi E stato osservato che questi mutanti sintetizzano sempre β-gal, anche in presenza di solo glucosio (mutanti costitutivi).

9 Il modello di regolazione negativa di Jacob e Monod Z Y A Geni strutturali Sulla base dei dati sui mutanti strutturali, Jacob e Monod ipotizzano che l utilizzazione del lattosio da parte delle cellule batteriche dipenda dall attività di 3 geni strutturali fisicamente adiacenti sul cromosoma circolare di E. coli. Questi geni codificano: la β galattosidasi (gene Z) la permeasi del lattosio (gene Y) la tiogalattoside transacetilasi (gene A) Inoltre, per poter spiegare le proprietà dei mutanti di regolazione, Jacob e Monod ipotizzano la presenza, a monte della regione strutturale, di una regione di controllo, che non codifica polipeptidi ma interagisce con proteine (geni P ed O). Infine, ipotizzano la presenza, lontano da questa regione, di un gene I che codifica un polipeptide coinvolto nella regolazione dei geni che provvedono all utilizzazione del lattosio. I O Z Y A P

10 I O Z Y A P Il gene I codifica la proteina repressore mrna codificante il repressore sintesi proteica repressore

11 I P O Z Y A In assenza di lattosio, il repressore interagisce con la regione O dell operone lac

12 I P O Z Y A L RNA polimerasi si lega al promotore ma non può procedere in direzione dei geni strutturali in quanto trova ostacolo all avanzamento avanzamento

13 I P O Z Y A Allolattosio I Il repressore è una proteina ALLOSTERICA che possiede anche un sito capace di legare il lattosio (o, meglio, l allolattosio). Quando l allolattosio interagisce con il repressore, quest ultimo perde la propria affinità per il. P O Z Y A

14 I P O Z Y A In queste condizioni, l RNA polimerasi non trova più ostacoli e può trascrivere i geni strutturali.

15 Operon 24 REPRESSORE ATTIVO REPRESSORE INATTIVO + INDUTTORE Il repressore può legarsi al Il repressore non può legarsi al IL REPRESSORE E UNA PROTEINA ALLOSTERICA

16 Operon REPRESSIONE lac I lac O lac Z lac Y lac A Z Y A

17 Operon INDUZIONE = DE-REPRESSIONE lac I lac O lac Z lac Y lac A Z Y A +

18 Spiegazione dei mutanti di regolazione: 1. Mutazioni a carico del gene I possono produrre un repressore che non ha affinità per il della regione O. In questo caso, i geni strutturali risultano essere sempre accesi, quindi la β- galattosidasi viene prodotta anche se non c è lattosio nel terreno di coltura delle cellule. (mutanti lac + costitutivi) 2. Mutazioni a carico del gene I possono produrre un repressore che ha affinità per il ma non per l allolattosio. In queste condizioni, il repressore non potrà staccarsi dal, i geni saranno sempre spenti e la β-galattosidasi non verrà quindi prodotta. (lac - di regolazione). 3. Mutazioni a carico della regione O alterano il sito responsabile dell interazione con il repressore, che non può legarsi al, indipendentemente dall allolattosio.

19 La regione lac funziona come un unica unità trascrizionale. Viene prodotto un unico mrna che comprende i tre geni strutturali, e che prende il nome di RNA messaggero poligenico o policistronico. Z Z Y Z Y A

20 Il concetto di operone Quando più geni strutturali che controllano una via metabolica sono sotto il controllo di un unica regione regolatrice, si dice che la regione in questione costituisce un OPERONE. La regione che provvede al controllo dell utilizzazione del lattosio viene quindi chiamata Operone lac. Il controllo dell espressione genica dell operone lac è di tipo NEGATIVO, in quanto affidato ad una proteina, il repressore, che quando si lega al INIBISCE la trascrizione dei geni strutturali sotto il suo controllo.

21 Operoni anabolici

22 Abbiamo analizzato il funzionamento degli operoni catabolici, che controllano la sintesi di enzimi responsabili dell utilizzazione dei disaccaridi. Vedremo ora il funzionamento degli operoni anabolici operoni anabolici, che controllano la sintesi degli enzimi responsabili delle vie metaboliche che portano alla produzione degli amminoacidi.

23 Le cellule batteriche possono sintetizzare tutti gli amminoacidi necessari per la sintesi delle proteine a partire da componenti semplici presenti nel terreno di coltura (zuccheri come fonte di carbonio, sali minerali come fonte di azoto, zolfo e fosforo). G1 G2 G3 G4 E1 E2 E3 E4 geni enzimi Precursore substrato 2 substrato 3 substrato 4 prodotto finale Prec. S2 S3 S4 P Esempio di via anabolica che porta alla sintesi di un amminoacido Ciascun gene codifica un enzima che catalizza una singola reazione della via anabolica nella quale a partire da un precursore semplice si arriva attraverso una serie di reazioni al prodotto finale, l amminoacido.

24 In queste condizioni, occorre che i geni codificanti gli enzimi che garantiscono il funzionamento della via metabolica siano inizialmente attivi. Questi geni sono anch essi raggruppati in operoni, e dipendono quindi da un unica regione di controllo. gene strutturale che codifica il repressore p o G1 G2 G3 G4 RNA polimerasi geni strutturali repressore inattivo Il repressore è inattivo: La RNA polimerasi non incontra ostacoli e può trascrivere i geni strutturali.

25 Attivazione del repressore gene strutturale che codifica il repressore p o RNA polimerasi complesso repressore-amminoacido L amminoacido, che è il prodotto finale della via metabolica, si lega al repressore facendogli cambiare conformazione e rendendolo attivo, quindi capace di legare il in corrispondenza della regione o. Questo accade quando la quantità di amminoacido è sufficiente a garantire un normale tasso di sintesi proteica. amminoacido Sintesi delle proteine

26 Regolazione a feedback delle vie metaboliche

27 Negli operoni anabolici, occorre che gli enzimi già sintetizzati nella fase di produzione degli amminoacidi vengano disattivati funzionalmente. Il controllo trascrizionale operato dal prodotto finale mediante interazione con il repressore provvede infatti ad interrompere la trascrizione di nuove molecole di enzima, ma quelli già presenti nella cellula continuerebbero a funzionare. G1 G2 G3 G4 Blocco della trascrizione E1 E2 E3 E4 geni enzimi Precursore substrato 2 substrato 3 substrato 4 prodotto finale Prec. S2 S3 S4 P Via metabolica ancora attiva, consumo di energia

28 Inibizione allosterica del primo enzima della via biosintetica da parte del prodotto finale. E1 E2 E3 E4 enzimi Precursore substrato 2 substrato 3 substrato 4 Prec. S2 S3 S4 P prodotto finale

29 I diversi livelli di regolazione da prodotto finale Prodotto finale della via metabolica P inibizione allosterica del 1 1 enzima Attività della via metabolica E1,... En Enzimi emivita breve RNA Transizione allosterica del Repressore repressione Trascrizione

30 Conclusioni: Il prodotto finale di una via anabolica (ad esempio, un amminoacido) deve essere sintetizzato quando la cellula lo richiede, in quantità sufficienti a garantire la sintesi proteica. Quando i livelli disponibili di prodotto finale superano le necessità,, viene inibita la trascrizione dei geni che codificano tutti gli enzimi della via metabolica interessata, attraverso l interazione l del prodotto finale con il REPRESSORE, il quale viene cosi reso attivo mediante transizione conformazionale. Gli mrna prodotti in precedenza hanno emivita breve, pertanto non sono più disponibili per la traduzione nel volgere di pochi minuti. Tuttavia, gli enzimi già sintetizzati in precedenza hanno emivita più lunga e continuerebbero a funzionare anche quando non è necessario. La proprietà del primo enzima della via metabolica di interagire con il prodotto finale quando questo raggiunge una concentrazione sufficiente e di subire una transizione conformazionale che lo rende inattivo permette di regolare in modo fine la via metabolica. m

31 Regolazione della trascrizione Controllo positivo

32 Che cosa succede quando le cellule vengono fatte crescere in un terreno contenente sia glucosio, sia lattosio? Dovremmo aspettarci, sulla base del modello di Jacob e Monod, che la presenza del lattosio induca i geni strutturali dell operone lac, con produzione di β-galattosidasi e scissione del lattosio. Invece, le cellule utilizzano il glucosio disponibile nel terreno e viene spento l operone lac. In particolare, se le cellule sono state fatte crescere in presenza di lattosio e si aggiunge glucosio, viene inibita la sintesi di β -galatosidasi. batteri β-galattosidasi La sintesi di β-gal viene inibita dall aggiunta di glucosio, nonostante la presenza nel terreno del lattosio. glucosio Lattosio

33 In seguito all aggiunta di glucosio, si osserva anche un calo drastico dei livelli di camp intracellulari. Si è ipotizzato che l effetto inibitorio da parte del glucosio sull espressione dell operone lac sia mediato dall AMP ciclico. ATP camp AMP Adenil ciclasi (AC) fosfodiesterasi (PDA) Via metabolica di sintesi dell AMP ciclico ATP camp AMP Adenil ciclasi (AC) fosfodiesterasi (PDA) Effetto del glucosio: inibizione dell adenil ciclasi, stimolazione della fosfodiesterasi. glucosio = camp glucosio

34 Quindi, la concentrazione intracellulare del camp è dipendente in misura inversamente proporzionale dalla concentrazione intracellulare del glucosio. E stata fatta l ipotesi che l AMP ciclico fosse coinvolto nella regolazione degli operoni la cui attivazione determina un aumento del glucosio intracellulare, quindi tutti gli operoni responsabili della degradazione di disaccaridi contenenti glucosio. Si è cercata una proteina capace di legare l AMP ciclico e anche il. camp camp camp camp Estratto di batteri camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp camp Le proteine che non hanno affinità per il camp non vengono trattenute dalla colonna. Quelle che si legano al camp possono essere recuperate facendo passare nella colonna camp libero (oppure abbassando il ph della soluzione colonna cromtografica di affinità per il camp sferette coniugate a camp proteine che non legano camp proteina che lega camp camp

35 Le proteine capaci di legare camp possono essere ulteriormente analizzate per quanto riguarda la loro capacità di legare il, usando un apposita colonna cromatografica. Proteine che legano l AMP ciclico + AMP ciclico Le proteine che hanno affinità per il vengono trattenute dalla colonna, quelle non affini passano indisturbate. Si è dimostrato che il legame alla colonna ha luogo solo in presenza di camp. Proteine che legano camp ma non il ph Proteine che legano camp e il

36 Quindi, una delle proteine che legano l AMP ciclico si lega al quando l AMP ciclico è presente, non quando questo è assente. Nella cellula, i livelli di camp dipendono da quelli del glucosio, come abbiamo visto. Quindi, il livello di glucosio intracellulare controlla l accesso di questa proteina (CAP protein) al : a) quando c è glucosio disponibile (quindi non c è camp), la proteina non si lega al. b) quando il glucosio non è disponibile (e c è molto camp), la proteina si lega al. Esperimenti ulteriori hanno permesso di dimostrare che la proteina CAP si lega ad una regione del promotore dell operone lac e anche a promotori di altri operoni la cui attivazione determina produzione intracellulare di glucosio.

37 p1 Senza glucosio p2 o z Se il lattosio è presente, il repressore è staccato dal sito o; i geni strutturali sono in teoria accessibili alla RNA polimerasi. Se è assente il glucosio, la cellula ha livelli elevati di camp, che si lega alla proteina CAP e favorisce l aggancio della RNA polimerasi. camp CAP RNA pol Repressore + allolattosio In queste condizioni, si ha trascrizione dei geni strutturali. p1 p2 Molto glucosio o z Se il lattosio è presente, il repressore è staccato dal sito o; i geni strutturali sono in teoria accessibili alla RNA polimerasi. CAP RNA pol Se è presente il glucosio, la cellula ha bassi livelli di camp, la proteina CAP non lega il e la RNA polimerasi non si aggancia al sito promotore. Repressore + allolattosio In queste condizioni, anche se nel terreno c è il lattosio, non si ha trascrizione dei geni strutturali.

38 Conclusioni. La proteina CAP esercita quindi un controllo positivo sulla trascrizione: infatti, legandosi al, essa FAVORISCE la trascrizione dei geni strutturali.