LEZIONE PROF. CARAGLIA 12/05/2017: SBOBINATORI: Giovanni Tortorella Leonardo Natola

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1 LEZIONE PROF. CARAGLIA 12/05/2017: SBOBINATORI: Giovanni Tortorella Leonardo Natola MIRNA Probabilmente quando vi laureerete ci saranno già mrna utilizzabili in diagnostica, al giorno d oggi non ci sono perché non sono stati ancora validati (facendo studi su migliaia di individui) Quali sono gli RNA nelle cellule eucariotiche? C è l mrna, che codifica per le proteine, ma codificano solo il 5% dei geni presenti nel DNA; trna, coinvolto nella sintesi proteica,traduce il codice nucleico in codice proteico; rrna, rna strutturale che costituisce i ribosomi. Questi RNA sono tutti particolarmente lunghi, da 500 a 5000 nucleotidi. Poi abbiamo gli small nuclear RNA, coinvolti nello splicing alternativo dei geni, con una lunghezza da 60 a 300 nucleotidi. Gli Small non coding RNA, lunghi nucleotidi, non codificano proteine, sono coinvolti nella regolazione dell espressione genica a livello post trascrizionale, hanno una specificità di sequenza variabile. Quello che a noi interessa è il paragone tra questi due tipi di RNA, il mirna e gli small interfering RNA, molto simili tra di loro. Anche questi ultimi sono coinvolti nella regolazione genica. COME VENGONO SINTETIZZATI I mirna: I mirna sono codificati da specifici geni eucariotici, i MIR, e presenti sia al mondo animale che al mondo vegetale. Nell uomo questi geni sono trascritti dalla polimerasi II e i trascritti (di diverse centinaia di nucleotidi) sono definiti PRI-miRNA, processati dalla RNasi di tipo III,detta Drosha, che agisce con un cofattore Pasha, generando strutture a forcina cioè un singolo filamento di RNA di nucleotidi ripiegato su se stesso, definite PRE-miRNA. Questo viene esportato nel citoplasma dalla esportina 5. Nel citoplasma interviene il Dicer (endonucleasi RNasi III) che taglia la testa di questa forcina, ottenendo un RNA a doppio filamento. I due filamenti vengono staccati da una proteina detta Argonauta. Avremo un frammento di accompagnamento (degradato) e Il master strand che viene caricato sul complesso multiproteico RISC (all'interno dei quali avviene l'interazione tra mirna ed RNA bersaglio) che si associa con complementarietà

2 imperfetta con l RNA messaggero bersaglio, in questo modo ne inibisce la traduzione,ma non ne induce la degradazione perché appunto l assemblaggio non avviene in maniera perfetta ma bensì IMPERFETTA. In genere in altri animali inferiori c è un appaiamento perfetto mrna-mirna, in questo caso, questo induce la formazione di un doppio filamento che viene degradato da una RNAsi che prende il nome di Slicer; tuttavia nell uomo invece non è così, perché l appaiamento imperfetto causa la formazione di una sorta di gobba che inibisce la progressione della sintesi proteica. Questa caratteristica, peculiare dei mirna umani, permette al singolo mirna di avere molteplici bersagli, quindi non è specifico per un mrna, ma bensì per una serie di mrna e quindi per una serie di proteine, aumentando l effetto biologico. mirna e CANCRO: Esiste una correlazione tra mirna e cancro proprio perché essi possono funzionare sia come oncosoppressori (inibendo inibendo i trascritti dei geni oncogeni), sia come oncogeni (inibendo i trascritti dei geni oncosoppressori), in base a cosa vanno a inibire. Fino ad oggi sono stati decodificati migliaia di mirna,che si indicano con il prefisso mir seguito da un numero, ma probabilmente il loro numero è destinato a salire. Di quelli decodificati se ne conosce più o meno la funzione, come per esempio let-7 inibisce RAS funzionando da tumor suppressor, viceversa mir-24 inibisce p16 che normalmente induce senescenza, di conseguenza mir-24 stimola la proliferazione e quindi si comporta da oncogene. mirna COME MARCATORI DIAGNOSTICI: Noi studiamo i mirna in biochimica clinica perché possono essere utilizzati come marcatori diagnostici, che non sono solo marcatori tissutali, ma anche circolanti( cioè sierici,contenuti nel siero). Sono tissutali perchè esistono diversi mirna che sono up regolati o down regolati in diversi tumori. Es: secondo tale studio (sl.12) nel tumore laringeo c è up-regolazione di mir125b e mir-145 e down-regolazione di mir rispetto al tessuto normale, questo ovviamente ci permette di differenziare le cellule tumorali rispetto alla controparte normale. Un altro esempio ci fa vedere come i mirna si comportano da

3 oncogeni, infatti mir-19a (sempre nei tumori laringei) inibisce l espressione di un oncosoppressore, TIMP 2, un inibitore della metalloproteasi 2. Di conseguenza, dopo l azione di mir-19a, le metalloproteasi 2 sono libere di agire potenziando il processo di metastatizzazione. Un altro esempio ancora ci fa vedere come mir-21 è più espresso nel tessuto tumorale laringeo) ed ha un ruolo nella regolazione(inibizione) di PTEN che è un oncosoppressore, quindi se io butto giù PTEN si attiva akt e quindi favorisce la sopravvivenza cellulare. Altri esempi: mir24 è down-regolato nel tessuto tumorale laringeo,questo mirna agisce come oncosoppressore rispetto a quelli che abbiamo visto precedentemente. Ancora, mir-27 nel tessuto tumorale è più espresso rispetto al tessuto normale, quindi agisce come un oncogene. I mirna sono quindi utilizzati come marcatori diagnostici, per differenziare il normale dal patologico(tumorale), ma possono essere utilizzati anche come marcatori predittivi dell estensione di una malattia(detti anche MARCATORI RADIALI) (cioè ci sono metastasi linfonodali, viscerali ecc..). Ad esempio mir106b correla con lo stadio del carcinoma laringeo,avendo alte espressioni negli stadi avanzati III e IV dove ci sono metastasi linfonodali.questo è quindi un marcatore radiale. Ricordiamo che i marcatori possono essere: diagnostico che ci fa fare la diagnosi e quello radiale che ci dice l estensione(cioè se è estesa o non estesa) della malattia (domanda d esame) Altri esempi ancora: mir-152, stessa cosa, è down regolato nei tessuti tumorali rispetto ai normali, sembrerebbe essere coinvolto nella induzione della proliferazione delle cellule tumorale di carcinoma laringeo in vitro mir-375 è associato al consumo di alcol etilico. Il carcinoma laringeo è indotto da alcol e HPV(i due fattori eziologici più importanti di questo tumore). Questo marcatore aumenta nei pazienti che hanno carcinoma laringeo e che hanno precedentemente avuto consumo di alcol etilico. (Slide 21)L'espressione di mir-375 nello stadio avanzato è ridotto ed è aumentato nello stadio precoce. Quindi, trovando contemporaneamente mir-375 e mir-106 puoi predire, ancora più precisamente, le

4 caratteristiche di diffusione del tumore. Quindi il futuro sarà andare a valutare una serie di mirna che ci permetteranno di analizzare precisamente la malattia. Quali sono i VANTAGGI di utilizzare i mirna rispetto ai normali metodi immunoistochimici di analisi del tessuto tumorale? Con i metodi immunoistochimici si dà una valutazione soggettiva in seguito al colore che si sviluppa nella reazione immunoistochimica. Con i mirna si dà una valutazione quantitativa,quindi più oggettiva. Un altro vantaggio dei mirna è che vengono SECRETI, e il meccanismo di secrezione avviene attraverso vescicole che si assemblano tra di loro impacchettando mirna e anche proteine. Questi corpi o si fondono con l endosoma e ciò che sta dentro viene degradato oppure vengono secreti come esosomi. Questi esosomi sono vescicole costituite da bilayer fosfolipidici che proteggono il mirna contenuto all interno. Noi possiamo dosarli nel sangue in maniera efficiente e possiamo anche conservare i prelievi dei pazienti fino a 10 anni, e possiamo anche congelare e scongelare il siero del paziente senza che i mirna si distruggano, grazie proprio a queste vescicole esosomiali che li proteggono dagli agenti esterni. Questi esosomi veicolano il contenuto a cellule vicine o distanti, quindi agiscono come dei veri e propri messaggeri ormonali. Sono contenuti in tutti i fluidi biologici (urine, sperma e fluidi vaginali,lacrime, sudore, saliva,latte,colostro,liquido amniotico,liq cefalorachidiano,liq pleurico e peritoneale,lavaggio bronchiale). Infatti molti di questi mirna, vengono ritrovati circolanti in molti tumori o nel sangue o nelle urine o nella saliva (sl 25). Nella Slide 25 c è un esempio di mirna come markers del tumore laringeo, tra i quali 15 up regolati e 9 down regolati presenti nel siero del paziente, che si associano alla diagnosi di tumore laringeo. Altri mirna sono utili nel diagnosticare il carcinoma polmonare non a cellule piccole, in particolare mir1254, mir574, mir485 molto efficienti nel diagnosticare la malattia nello stadio III e IV, quindi in stadi avanzati. Se io trovo quindi i valori di questi mirna alterati non ho la necessità di fare un TAC per la diagnosi di carcinoma del polmone. Lo stesso vale per mirna 21 che viene utilizzato come MARCATORE PROGNOSTICO ovvero una sua elevata espressione correla una

5 maggiore sopravvivenza di questi pazienti rispetto a pazienti che presentano livelli più bassi di questo mirna. Quindi, ricapitolando, abbiamo: -MARCATORI DIAGNOSTICI: ci fanno fare diagnosi di malattia -MARCATORI RADIALI: ci fanno valutare l estensione della malattia -MARCATORI PROGNOSTICI: ci permettono di valutare l evoluzione della malattia e quindi l effetto sulla sopravvivenza del paziente. Uno studio sul mesotelioma pleurico: si vede che ci stanno dei mirna, nel siero del paziente, deregolati, che correlano con un istotipo e una determinata prognosi. In particolare abbiamo signature A e signature B( combinazioni di mirna) con diversa regolazione dei mirna e quindi diversa prognosi/istotipo. Domanda e risposta incomprensibili