MECCANISMI DI VARIABILITA GENETICA

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1 GENETICA BATTERICA

2 MECCANISMI DI VARIABILITA GENETICA La biodiversità nei microrganismi, come in tutti i viventi, dipende da un buon equilibrio tra i processi di conservazione e quelli di cambiamento del materiale genetico. I processi molecolari e cellulari atti alla trasmissione invariante del genoma ( duplicazione DNA, riproduzione asessuata) sono integrati da altri processi che permettono di rimescolare i geni e riarrangiare i cromosomi ( es. ricombinazione e riproduzione sessuata ). N.B. E necessario ripassare i processi di divisione cellulare e la riproduzione : ( mitosi, meiosi, riproduzione asessuata nei procarioti, riproduzione sessuata, cicli riproduttivi).

3 MECCANISMI DI RICOMBINAZIONE Analizziamo sinteticamente alcuni meccanismi di ricombinazione: a) Ricombinazione omologa o generale b) Ricombinazione sito- specifica c) Ricombinazione per trasposizione

4 Ricombinazione omologa La ricombinazione omologa può coinvolgere due sequenze omologhe qualsiasi; avviene con il crossing over tra tetradi durante la profase della meiosi. Essa svolge tre funzioni: 1. contribuisce alla riparazione dei diversi tipi di danneggiamento del DNA; 2. rende possibile il contatto fisico tra cromatidi non fratelli di una coppia di cromosomi omologhi, importante per avere una corretta segregazione dei cromosomi omologhi alla prima divisione meiotica; 3. Contribuisce alla diversità genetica di una popolazione.

5 Ricombinazione omologa durante la meiosi

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7 Ricombinazione sito- specifica La ricombinazione sito- specifica avviene tra due elementi di DNA in cui sono presenti due siti di ricombinazione caratterizzati da corte regioni di omologia; i siti di ricombinazione sono riconosciute da proteine( ricombinasi) che avvicinano i due siti, tagliano i filamenti di DNA e li riattaccano dopo lo scambio. La ricombinazione sito - specifica può dar luogo a cambiamenti diversi nel genoma ( es. inserzione o escissione di un tratto di DNA ).

8 Ricombinazione sito- specifica

9 Ricombinazione per trasposizione Si tratta di segmenti di DNA presenti in tutte le cellule, che si spostano da un punto di un cromosoma ( sito del donatore) a un altro nello stesso cromosoma o in uno diverso ( il sito bersaglio) Non è necessaria omologia tra il trasposone e il sito di integrazione, quindi l inserimento può avvenire in qualsiasi punto del genoma. Il processo della trasposizione può avvenire con modalità differenti : - meccanismo taglia - incolla - trasposizione con duplicazione del trasposone oltre al trasferimento.

10 RICOMBINAZIONE NEI MICRORGANISMI TRASFORMAZIONE CONIUGAZIONE TRASDUZIONE

11 TRASFORMAZIONE Grifft ha individuato il primo meccanismo di scambio genetico nei batteri e ha posto le basi per dimostrare che l informazione genetica è codificata dalla molecola del DNA. Analizzando le figure che seguono si possono seguire le diverse fasi dell esperimento di Grifft.

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14 TRASFORMAZIONE Condizioni necessarie sono: -LapresenzadiDNAlibero. - Stato di competenza della cellula ricevente. La cellula è normalmente impermeabile al DNA, a meno che non si trovi in uno stato di competenza (formazione di pori transitori nella membrana che permettono il passaggio di molecole di DNA). A questo punto i frammenti di DNA entrano, si appaiano e possono ricombinarsi(a sinistra)

15 Cellule competenti Le cellule possono essere rese competenti in modo artificiale: - trattamento in soluzione di CaCl 2 - elettroporazione I batteri Gram-negativi vengono trattati con agenti chimici o fisici, quindi il DNA attraversa il doppio strato della membrana esterna e della membrana citoplasmatica e raggiunge i siti dove può essere espresso e replicato. I batteri Gram-positivi non possiedono la membrana esterna propria degli organismi gram-negativi. Tuttavia l ingresso del DNA è impedito dalla presenza di uno strato rigido esterno di mureina o peptidoglicani, che è molto più spesso del suo equivalente nei batteri gram- negativi. Questo strato deve essere preventivamente idrolizzato con lisozima, quindi i protoplasti (cioè i batteri senza parete cellulare) si possono trasformare. Negli studi di ingegneria genetica, per trasferire DNA nelle cellule è stato necessario trovare un modo per rendere competente Escherichia coli.

16 CONIUGAZIONE BATTERICA Esperimento di Lederberg- Tatum, 1946, E. coli Utilizzo di mutanti poliauxotrofici, per escludere retromutazioni che diano falsi positivi Ceppo a. E. coli met- bio- thr+ leu+ x Ceppo b. E. coli met+ bio+ thr- leu met+ bio+ thr+ leu+ exconiuganti o ricombinanti

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18 Non compaiono cellule prototrofe: perché avvenga la coniugazione è necessario il contatto fisico fra i due ceppi

19 Escludono trasformazione seminando in tubo a U, con terreno minimo e filtro permeabile a DNA, aa, virus ma non batteri. Concludono che è necessario contatto fisico

20 In cosa differisce la coniugazione batterica dalla coniugazione negli eucarioti, anche microbici? I ceppi parentali non mettono in compartecipazione il loro intero genoma - non si formano figli diploidi, e - non si ha segregazione dei caratteri parentali Il contributo dei genomi parentali alla composizione genomica del genoma ricombinante è asimmetrico: - un batterio funge da ricevente, l altro da donatore Un batterio donatore può trasmettere con alta frequenza al ricevente la capacità di fungere da donatore - Fattore di fertilità F: un elemento "infettivo Batteri F+: donatori - di marcatori genetici - di F Batteri F-: riceventi

21 Coniugazione batterica: F+ x F- Trasferimento del plasmide F da un batterio donatore ad un ricevente mediante coniugazione. La coniugazione può avvenire tra ceppi della stessa specie o tra ceppi di specie e generi diversi (anche se con una frequenza minore) Il DNA viene trasferito con un meccanismo noto come rolling circle, che prevede la formazione di un intermedio a singolo filamento Completato il trasferimento entrambe le cellule contengono una copia completa del plasmide F e possono comportarsi da donatore.

22 Coniugazione batterica Hfr x F- La cellula batterica Hfr ha il plasmide integrato nel cromosoma batterico; si tratta di cellule ad alta frequenza di ricombinazione. L integrazione del plasmide F non avviene in regioni casuali del genoma batterico. nella coniugazione Hfr e F- anche geni del cromosoma batterico possono essere trasferiti da una cellula donatore a una cellula ricevente. l elica intatta funge da stampo nel donatore, quella interrotta incomincia a essere trasferita. solo pochi geni di norma si trasferiscono, perchè l intero cromosoma richiede tempi lunghi e il ponte di coniugazione si rompe facilmente. Le cellule riceventi rimangono F-, ma sono caratterizzate da una maggiore frequenza di ricombinazione.

23 TRASDUZIONE Processo ricombinante osservato per la prima volta da Zinder. (1952) lavorando con due ceppi auxotrofi : - Ceppo auxotrofo phe-,trp-, tyr- - Ceppo auxotrofo met-, his- Inoculati insieme in terreno minimo hanno ottenuto colonie, quindi comparsa di ricombinanti. Le prove con tubo a U e trattamento con DNasi facevano escludere sia la coniugazione sia la trasformazione Quale spiegazione dare al fenomeno? Ipotizzarono che l agente trasformante poteva essere un virus; tale ipotesi ha avuto conferma con successive esperienze.

24 TRASDUZIONE Per capire il processo di ricombinazione genetica mediante virus ( trasduzione) è necessario analizzare le modalità di riproduzione virale all interno della cellula batterica, che risultano evidenziate nelle successive slide.

25 Ciclo litico e ciclo lisogeno

26 QUAL E IL SIGNIFICATO DELLA LISOGENIA? Per i batteriofagi (virus): - attesa di tempi migliori per riprodursi, in quanto la replicazione può portare all eliminazione delle cellule ospiti. Per i batteri (ospite): - stato di immunità nei confronti dell infezione da parte dello stesso virus ; - trasferimento orizzontale di geni batterici alla base del processo di trasduzione

27 SIGNIFICATO LISOGENIA Per i batteriofagi (virus): - attesa di tempi migliori per riprodursi, in quanto la replicazione può portare all eliminazione delle cellule ospiti. Per i batteri (ospite): - stato di immunità nei confronti dell infezione da parte dello stesso virus ; - trasferimento orizzontale di geni batterici alla base del processo di trasduzione

28 TRASDUZIONE IL processo di trasduzione permette il trasferimento di geni da batterio a batterio ad opera di batteriofagi. In base al meccanismo con cui avviene il trasferimento dei geni si possono distinguere due tipi di trasduzione: - trasduzione generalizzata: trasferimento di qualsiasi segmento di genoma batterico - trasduzione specializzata : trasferimento di un limitato numero di geni specifici

29 TRASDUZIONE GENERALIZZATA Errori nel montaggio dei fagi determinano incorporazione del DNA batterico nel capside,avente dimensioni uguali a quello del fago. Il DNA trasdotto giunto nella cellula ricevente può: 1. Integrarsi al cromosoma dell ospite 2. essere denaturato. N.B. Il virus trasducente generalmente non riesce a replicarsi proprio per mancanza di genoma completo.

30 TRASDUZIONE SPECIALIZZATA LaTrasduzioneSpecializzata richiede l integrazione del genoma virale nel cromosoma batterico e viene quindi effettuata solo da virus LISOGENI. LaTrasduzioneSpecializzata determina quindi il trasferimento, con elevata efficienza, di geni batterici posti vicino al sito di integrazione del profago lisogeno. (DNA misto ). Il distacco del DNA misto potrà essere incapsidato in una particella fagica che in caso di successiva infezione dei fagi potrà essere inserito in regioni di omologia nella cellula ricevente.