Curriculum scientifico Prof Roberta Bianchi

Transcript

1 Curriculum scientifico Prof Roberta Bianchi In oltre 30 anni di ricerca nel campo dell immunoterapia antitumorale e recentemente in quello dell autoimmunità, la prof.ssa Bianchi è autore di oltre 70 articoli che appaiono in MEDLINE. Le tematichedi ricerca sono articolate nei seguenti settori: A - Immunomodulazione con citochine ed anti-citochine B - Modulazione farmacologica del catabolismo del triptofano e tolleranza immunitaria C Indolamina 2,3-diossigenasi (IDO): un nuovo bersaglio farmacologico per la prevenzione del rigetto ai trapianti e per il controllo di patologie autoimmunitarie D Comunicazione intercellulare bidirezionale e sviluppo di nuovi farmaci biotecnologici in oncologia A - Immunomodulazione con citochine ed anti-citochine L'immunità, l'infiammazione ed il riparo dei tessuti sono regolati in modo essenzialmente paracrino da prodotti secreti da linfociti, monociti, fibroblasti, cellule endoteliali ed altri tipi cellulari. Questi prodotti comprendono la famiglia di ormoni proteici nota come citochine, e rappresentata da interferoni, linfochine, linfotossine, fattori di necrosi tumorale, e fattori di crescita di differenziazione cellulare noti come colony-stimulating factors. Nel mentre la sperimentazione preclinica di molte citochine è oggetto di intenso studio, alcune di queste sono già entrate in fase di sperimentazione clinica, o sono parte integrante di specifici protocolli terapeutici per talune condizioni morbose, soprattutto neoplastiche. Dell'interferone gamma è stato dimostrato il ruolo chiave di molecola effettrice nei meccanismi generali di resistenza acquisita in seguito alla somministrazione di vaccini di cellule tumorali. Inoltre, è stata dimostrata anche la funzione inibitoria di tale citochina nella presentazione in vivo di antigeni tumorali o di antigeni coinvolti nella patogenesi del diabete insulino-dipendente, un dato pertanto rilevante non solo ai fini di strategie immunoterapiche antitumorali ma anche nell autoimmunità. Dell'interleuchina-6, a mezzo di citochina ricombinante e anticorpi specifici anti-citochina, è stato dimostrato l'effetto adiuvante nella risposta immunitaria in vivo ad antigeni tumorali ed autoantigeni presentati da cellule dendritiche autologhe.

2 Dell'interleuchina-12, a mezzo di citochina ricombinante e anticorpi specifici anti-citochina, è stato dimostrato l'effetto adiuvante in vaccini antitumorali specifici costituiti da cellule dendritiche autologhe, esposte a peptidi sintetici. Dell'interleuchina-23, a mezzo di una proteina di fusione a catena singola, è stato dimostrato l'effetto adiuvante nella risposta immunitaria in vivo ad antigeni tumorali presentati da sottopopolazioni di cellule dendritiche autologhe. Nel complesso questi studi sottolineano come molte delle citochine note, attualmente disponibili in forma ricombinante, od alcuni loro antagonisti recettoriali o funzionali, permettano una molteplicità di prospettive terapeutiche, nel trattamento non solo di forme neoplastiche ed infettive ma anche di specifiche forme di ipo- o dis-reattività immunitaria. B - Modulazione farmacologica del catabolismo del triptofano e tolleranza immunitaria Nell'ambito degli studi relativi alla messa a punto di vaccini antitumorali costituiti da cellule dendritiche e peptidi sintetici, è stato inoltre possibile dimostrare che l'incapacità di cellule dendritiche spleniche di presentare il peptide tumorale P815AB è imputabile ad una minoranza di cellule dendritiche linfoidi a fenotipo CD8 +. La rimozione di tali cellule determina infatti una presentazione efficace del peptide da parte di cellule dendritiche mieloidi a fenotipo CD8 -. Mentre il pretrattamento di cellule dendritiche mieloidi con IL-12 permette il superamento dell'inibizione esercitata da cellule dendritiche linfoidi, il pretrattamento con IFN-g di cellule linfoidi ne potenzia l'effetto inibitorio, tanto da indurre nell'animale una condizione di tolleranza irreversibile nei confronti dell'antigene. L'effetto di IFN-g può essere impedito dalla stimolazione di cellule dendritiche linfoidi con un anticorpo agonista del recettore 4 CD40 oppure con la citochina IL-6. Dati analoghi sono stati ottenuti con il peptide NRP-A7, un mimotopo riconosciuto da linfociti T diabetogenici nel topo NOD (nonobese diabetic), suggerendo pertanto che analoghi meccanismi regolino la presentazione in vivo di antigeni tumorali e di antigeni self o autoantigeni. Il meccanismo di potenziamento della funzione inibitoria delle cellule dendritiche linfoidi da parte di IFN-g è strettamente associato all'induzione di indolamina 2,3-diossigenasi (IDO), un enzima coinvolto nel catabolismo del triptofano attraverso il pathway delle chinurenine. Infatti, il trattamento con 1-metiltriptofano, un potente inibitore competitivo di IDO, abolisce completamente l'effetto inibitorio di cellule

3 dendritiche linfoidi trattate con IFN-g. Inoltre, l'effetto preventivo associato alla stimolazione del recettore CD40 oppure al trattamento con IL-6 correla con una mancata induzione di IDO. Elevati livelli di espressione e di attività enzimatica di IDO sono peculiari di cellule dendritiche linfoidi, come dimostrato da uno studio comparativo di varie sottopopolazioni di cellule dendritiche e macrofagi, e correlano con l'induzione di apoptosi di cloni linfocitari T antigene-specifici. Nonostante il pathway delle chinurenine sia noto da molto tempo, in particolar modo a livello del sistema nervoso centrale e nell'ambito dei meccanismi di difesa contro batteri e cellule tumorali, solo recentemente IDO è apparso sulla scena dell'immunologia. Il gruppo statunitense di Mellor e Munn ha recentemente dimostrato che la somministrazione di 1-metiltriptopfano (1-MT) a topoline gravide determina un rapido rigetto del prodotto di concepimento. La scoperta del coinvolgimento di IDO nella regolazione della tolleranza immunitaria ad antigeni presentati da cellule dendritiche è pertanto in linea con tali dati e ne sottolinea ulteriormente il ruolo cruciale. C Indolamina 2,3-diossigenasi (IDO): un nuovo bersaglio farmacologico per la prevenzione del rigetto ai trapianti e per il controllo di patologie autoimmunitarie L immunità specifica fornisce ai vertebrati la possibilità di sorvegliare e rispondere ad una grande diversità di antigeni. Il repertorio dei linfociti T deve tuttavia essere accuratamente regolato per prevenire risposte contro gli antigeni self. Pertanto, l induzione ed il mantenimento di tolleranza immunologica rappresenta l obiettivo chiave per la terapia di patologie autoimmunitarie e per l attecchimento permanente di organi trapiantati. La strategia ideale non dovrebbe colpire indiscriminatamente tutte le cellule T, ma solo quelle specifiche per quell autoantigene o per l organo trapiantato. L attivazione antigene-specifica del linfocita T è regolata da segnali costimolatori, come il recettore CD28, ed inibitori, come il recettore CTLA-4 che compete con CD28 per l interazione con gli stessi ligandi, B7-1 e B7-2, espressi sulla membrana di cellule presentanti l antigene come macrofagi e cellule dendritiche. CTLA-4-Ig, una forma solubile del recettore CTLA-4, è un potente immunosoppressore capace di prevenire il rigetto dell allotrapianto di insule pancreatiche, del cuore e del fegato, oltre ad impedire lo sviluppo del diabete e di encefalomielite sperimentale allergica in modelli sperimentali murini. Un aspetto rilevante della terapia con CTLA-4-Ig è che in primo luogo l effetto immunosoppressivo è specifico per l autoantigene o

4 alloantigene e che, in secondo luogo, permane anche in seguito ad interruzione del trattamento. La somministrazione dell inibitore competitivo di IDO, 1-MT, a topi diabetici trapiantati con insule pancreatiche allogeniche e trattati con CTLA-4-Ig comporta l annullamento dell azione farmacologica immunosoppressiva con conseguente reazione di rigetto. Tale dato sperimentale suggerisce che il meccanismo d azione di CTLA-4-Ig è mediato dall enzima IDO e indica tale enzima come un fondamentale bersaglio farmacologico per l attecchimento dei trapianti. Da studi in vivo ed in vitro, è stato possibile dimostrare che l induzione di IDO da parte di CTLA-4-Ig si verifica nelle cellule dendritiche, sottolineando così il ruolo centrale giocato da tali cellule nella regolazione della risposta immunitaria. Inoltre, tali studi mettono in evidenza che le molecole CTLA-4, B7-1 e B7-2 possono fungere sia da recettore che da ligando e smascherano pertanto un importante meccanismo di comunicazione bidirezionale tra linfocita T e cellula dendritica, già ipotizzato in uno studio precedente e che potrebbe essere rilevante anche nel controllo dell omeostasi T linfocitaria. Tali studi potrebbero aprire la strada allo sviluppo di nuovi farmaci immunosoppressori più selettivi e più potenti per la prevenzione del rigetto ai trapianti e per il controllo di patologie autoimmunitarie, spostando l obiettivo del bersaglio cellulare dal linfocita T alla cellula dendritica. Nell ambito dell autoimmunità, uno studio di recente pubblicazione ha infatti messo in evidenza che l enzima IDO è scarsamente inducibile da IFN-g nelle cellule dendritiche di topi NOD di sesso femminile che sviluppano diabete di tipo 1 con un alta incidenza. Tale difetto correla con un basso potenziale tollerogenico di cellule dendritiche nella presentazione in vivo dell autoantigene NRP-A7 ed è imputabile alla produzione di elevati livelli di perossinitriti, i quali, nitrosilando residui di tirosina della molecola Stat1, impediscono la trasduzione del segnale attivata da IFN-g. Il trattamento ex vivo delle cellule dendritiche del topo NOD femmina con guanidinoetildisolfuro (GED), un inibitore selettivo dell enzima NOS inducibile e scavenger di perossinitriti, ripristina la capacità di IFN-g di attivare IDO e, contemporaneamente, di indurre una potente funzionalità tollerogenica verso autoantigeni. D Comunicazione intercellulare bidirezionale e sviluppo di nuovi farmaci biotecnologici in oncologia

5 Lo sviluppo e l omeostasi di organismi pluricellulari richiede dei sistemi altamente sofisticati di comunicazione cellulare. E noto da lungo tempo che la comunicazione cellula-cellula si esplica normalmente secondo una linea unidirezionale che si sviluppa a partire dalla cellula che esprime il ligando, in forma solubile oppure ancorato alla membrana, fino alla cellula che esprime il recettore. Tuttavia, anche se molto sporadici, sono emersi recentemente dei casi in cui le cellule possono comunicare anche in modo bidirezionale, utilizzando una determinata coppia di ligando/recettore, dove ogni partner molecolare può fungere al tempo stesso sia da ligando che da recettore. Come illustrato in precedenza, le molecole CTLA-4 (prima considerato solo recettore) e B7 (prima considerato solo ligando) rappresentano un nuovo esempio di comunicazione bidirezionale. Tuttavia, il sistema CTLA-4/B7 potrebbe essere in realtà più complesso: è noto infatti che le molecole B7 espresse dalle cellule dendritiche possono interagire non solo con CTLA-4 ma anche con CD28, un recettore costimolatorio espresso costitutivamente sulla superficie dei linfociti T che concorre all attivazione e proliferazione di tali cellule. Nel tentativo di chiarire se anche CD28 sia capace di fungere da ligando per i recettori B7, è stato generata la proteina biotecnologica CD28-Ig, costituita dal dominio extracellulare di CD28 e la stessa coda immunoglobulinica utilizzata per costruire CTLA-4-Ig. Conducendo esperimenti in vitro, è stato possibile dimostrare che, contrariamente alle aspettative, CD28-Ig non è un antagonista ma un agonista dei recettori B7 espressi dalle cellule dendritiche, anche se gli effetti evocati sono completamente opposti rispetto a quelli dell agonista CTLA-4-Ig: invece di indurre la produzione di elevati livelli di IFN-g e l attivazione di IDO con conseguente acquisizione di proprietà tollerogeniche, CD28-Ig induce la produzione di elevati livelli della citochina proinfiammatoria IL-6 e consente alla cellula dendritica di acquisire un fenotipo funzionale altamente stimolatorio per i linfociti T. L effetto immunostimolante di CD28-Ig è risultato ancora più evidente in vivo, dove tale molecola, se somministrata ad animali neoplastici, ha indotto la completa regressione della patologia dopo solo due settimane di trattamento. Tale regressione si accompagna all instaurarsi di uno stato di memoria immunologica che permette agli animali di rigettare trapianti successivi con lo stesso tumore anche in assenza di trattamento. L efficacia di CD28-Ig come immunoterapico antitumorale richiede la produzione di IL-6, la quale, oltre che potenziare in modo autocrino le capacità stimolatorie delle cellule dendritiche sembrerebbe anche ridurre le funzioni soppressive delle cellule T regolatorie, iniziatrici dell induzione di IDO e probabili responsabili

6 dello stato di immunosoppressione che spesso si riscontra nei pazienti neoplastici. Tali dati aprono la strada alla generazione di nuovi farmaci biotecnologici a potente attività immunostimolante che potrebbero essere di valido ausilio in campo oncologico nonché in malattie infettive associate a immunodepressione. Dal punto di visto più generale, tali dati permettono inoltre di allargare ulteriormente le nostre conoscenze in campo di comunicazione intercellulare e di proporre un nuovo dogma: non solo i ligandi possono fungere da recettori e viceversa, ma diversi ligandi che attivano lo stesso recettore possono indurre effetti funzionalmente opposti. Tale scoperta apre nuove prospettive di intervento in molteplici campi, quali la trapiantologia, l autoimmunità e l oncologia.