Equilibrio di Gibbs-Donnan

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1 Equilibrio di GibbsDonnan Tra due soluzioni acquose separate da una membrana che sia impermeabile ad uno solo dei soluti si stabilisce un equilibrio (equilibrio di Donnan) garantito da una differenza di potenziale transmembranaria. Una conseguenza dell equilibrio di Donnan è che tra i due compartimenti si stabilisce una differenza di pressione osmotica: la pressione osmotica è maggiore nel compartimento contenente lo ione non diffusibile.

2 Equilibrio di GibbsDonnan Immaginiamo un recipiente diviso da una membrana in due compartimenti (1 e 2) che contengono, rispettivamente, una soluzione di KCl ed una di proteinato di K (KPr) in concentrazioni inizialmente equimolari (10 mm). Immaginiamo, inoltre, che la membrana sia permeabile al K e al Cl, ma non al Pr.

3 Equilibrio di GibbsDonnan Le frecce nere indicano flussi secondo gradiente di concentrazione Le frecce bianche indicano flussi secondo gradiente eletttrico 1) Gli ioni Cl diffondono da 1 a 2 secondo il loro gradiente di concentrazione, ma così facendo creano un gradiente elettrico che li spinge in direzione opposta. 2) Il gradiente elettrico creato dalla diffusione degli ioni Cl richiama ioni K da 1 a 2, ma così facendo gli ioni K creano un gradiente di concentrazione che li spinge in direzione opposta. Quando i flussi unidirezionali contrapposti diventano uguali sia per il K che per il Cl, il flusso netto transmembranario diventa pari a 0 sia per il K che per il Cl

4 Equilibrio di GibbsDonnan Le frecce nere indicano flussi secondo gradiente di concentrazione Le frecce bianche indicano flussi secondo gradiente eletttrico In queste condizioni la differenza di potenziale che si instaura a cavallo della membrana coincide con il potenziale di equilibrio dei due ioni (E K = E Cl ) previsto dall equazione di Nerst. E K E Cl RT [ K] ln z F K [ K] Dal momento che z K = 1 e z Cl = 1, ne consegue che: 1 2 RT [ Cl] xln zclf [ Cl] 1 2 [ [ K] 2 [ Cl] K] 1 [ Cl] 2 quindi [ K][ 1 Cl] 1 [ K] 2[ Cl] 2 Relazione di Donnan 1 I prodotti delle concentrazioni degli ioni permeanti nei due compartimenti sono uguali tra loro.

5 Equilibrio di GibbsDonnan Per il principio dell elettroneutralità delle soluzioni, in ogni soluzione il numero di ioni positivi è uguale al numero di ioni negativi. Pertanto nel compartimento 1 si avrà: [K ] 1 = [Cl ] 1 mentre nel compartimento 2 si verificherà che: [K ] 2 = [Cl ] 2 [Pr ] 2 Quindi, la concentrazione totale degli ioni diffusibili (K e Cl ) è maggiore dal lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr ): [K ] 2 [Cl ] 2 >[K ] 1 [Cl ] 1

6 Equilibrio di GibbsDonnan Cosa comporta l equilibrio di GibbsDonnan? La concentrazione totale degli ioni diffusibili (K e Cl ) è maggiore dal lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr ): [K ] 2 [Cl ] 2 >[K ] 1 [Cl ] 1 Un aumento di pressione osmotica dal lato dello ione non diffusibile

7 Equilibrio di GibbsDonnan All interno di una cellula vi sono molti anioni osmoticamente attivi piuttosto impermeabili, tipo proteinati e nucleotidi. Un equilibrio di GibbsDonnan porterebbe a una disparità di pressione osmotica tra l interno e l esterno della cellula. Lo squilibrio osmotico causerebbe l ingresso d acqua e lo scoppio della cellula

8 Equilibrio di GibbsDonnan Perché una cellula non subisce un rigonfiamento osmotico per effetto Donnan e infine non si rompe? Una spiegazione è che la cellula pompa attivamente Na esternamente, riducendo la pressione osmotica nel citoplasma e incrementando quella del liquido extracellulare

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10 Potenziale di membrana A cavallo della membrana plasmatica, quindi tra la superficie intra ed extracellulare del doppio strato fosfolipidico, di tutte le cellule esiste una differenza di potenziale detta potenziale di membrana. Esempi di potenziale di membrana

11 Potenziale di membrana A cavallo della membrana plasmatica, quindi tra la superficie intra ed extracellulare del doppio strato fosfolipidico, di tutte le cellule esiste una differenza di potenziale detta potenziale di membrana. La differenza di potenziale esistente tra i due lati della membrana plasmatica può essere misurata sperimentalmente inserendo un elettrodo in una cellula ed un secondo elettrodo nel liquido extracellulare.

12 Potenziale di membrana Per convenzione l'elettrodo extracellulare fa da terra, cioè da riferimento ed è settato a 0 mv. Se l'elettrodo extracellulare è macroscopico, l'elettrodo inserito in cellula è microscopico, tale da adeguarsi alle dimensioni cellulari. E' costituito da una micropipetta riempita da una soluzione elettrolitica in cui è immerso un filo d'argento collegato al voltmetro. La differenza di potenziale a cavallo della membrana plasmatica è generalmente negativa verso il citoplasma e positiva verso l'esterno della cellula. Il suo valore assoluto varia a seconda del tipo cellulare. Nelle cellule nervose è mediamente intorno a 70 mv.

13 Potenziale di membrana Il potenziale di membrana rappresenta una delle caratteristiche più rilevanti della Fisiologia cellulare: in molte cellule il potenziale di membrana è funzionale al trasporto transmembranario di metaboliti o sostanze nutritive, alla regolazione del ph intracellulare e alla regolazione del volume cellulare. Nelle cosiddette cellule eccitabili, neuroni e cellule muscolari, transitorie variazioni del potenziale di membrana rappresentano segnali elettrici la cui insorgenza e propagazione sono alla base del funzionamento del sistenma nervoso e di quello muscolare.

14 Potenziale di membrana La separazione di cariche a cavallo della membrana plasmatica, detta potenziale di membrana, avviene solo a cavallo della membrana mentre il citoplasma e il liquido extracellularesono elettroneutre.

15 Le cellule presentano una d.d.p. stazionaria nel tempo, e posseggono concentrazioni ioniche intracelluari stabilmente diverse da quelle extracellulari

16 Nella maggior parte delle cellule, un certo numero di ioni non è in equilibrio tra il liquido extracellulare e il citoplasma Esempio Muscolo Scheletrico di Rana: Potenziale di Riposo: 90 mv Extra Intra Potenziale Cellulare Cellulare di Equilibrio [Na ] 120 mm 9.2 mm 67 mv [K ] 2.5 mm 140 mm 105 mv [Cl ] 120 mm 34 mm 89 a 96 mv Il Cl è dunque prossimo al suo equilibrio Il Na è lo ione che si trova più lontano da una distribuzione di equilibrio Inoltre, il pot. di membrana non é un potenziale di GibbsDonnan, poiché non si é all'equilibrio, la cellula tende a perdere K e ad acquisire Na.

17 Come si genera il potenziale di membrana? Il potenziale di membrana è essenzialmente un potenziale di diffusione che scaturisce: dalla ineguale distribuzione di ioni sui due versanti della membrana, quindi nei gradienti di concentrazione ionica tra ambiente intracellulare ed extracellulare, generati e mantenuti dalla pompa NaKATPasi dalla diseguale permeabilità agli ioni da parte della membrana plasmatica. (Per permeabilità si intende la capacità di transito degli ioni attraverso canali ionici specifici) Gli ioni maggiormente coinvolti nella genesi del potenziale di membrana sono Na e K. Gli ioni Na sono più concentrati nel liquido extracellulare che dentro la cellula, gli ioni K sono più concentrati in cellula che nel liquido extracellulare. Inoltre, la membrana delle cellule è circa 40 volte più permeabile agli ioni K che agli ioni Na.

18 Come si genera il potenziale di membrana? P K > P Na 1 : 0.02 K 5 mm Na 150 mm Cl 128 mm citoplasma K Na K 150 mm Na 15 mm Cl 8 mm Proteinati Liquido extracellulare 1) Il K, essendo più concentrato all'interno della cellula, ed avendo una elevata permeabilità attraverso la membrana, tende a fuoriuscire dalla cellula. 2) Nel momento in cui gli ioni K si affacciano sul versante extracellulare della membrana caricano positivamente il versante extracellulare, mentre il versante intracellulare della membrana stessa si carica negativamente. 3) Si crea quindi ai due lati della membrana un gradiente elettrico. Tale gradiente elettrico rallenta il movimento degli ioni K, in quanto si oppone alla loro fuoriuscita.

19 P K > P Na 1 : 0.02 K 5 mm Na 150 mm Cl 128 mm Come si genera il potenziale di membrana? K Na K 150 mm Na 15 mm Cl 8 mm Proteinati citoplasma Liquido extracellulare Se il K fosse l'unica specie permeante attraverso la membrana, la forza elettrica derivante dalla separazione di cariche a cavallo della membrana diventerebbe di eguale ampiezza al gradiente di concentrazione chimico che guida gli ioni K a uscire dalla cellula. In tali condizioni il movimento netto di K attraverso la membrana si arresterebbe e si raggiungerebbe il potenziale di equilibrio del K In realtà, il valore del potenziale di equilibrio per il K calcolato si avvicina ma non corrisponde al potenziale di membrana, in quanto è più negativo. Questo dipende dal fatto che la membrana è permeabile, anche se in misura minore, al Na. Pertanto, la differenza di potenziale generata dal movimento del K accelera il movimento del Na facilitando il suo ingresso in cellula, rendendo, così, il potenziale di membrana meno negativo rispetto al potenziale di equilibrio del K.

20 Come si genera il potenziale di membrana? P K > P Na 1 : 0.02 K 5 mm Na 150 mm Cl 128 mm citoplasma K Na K 150 mm Na 15 mm Cl 8 mm Proteinati Liquido extracellulare Pertanto: a) il flusso netto passivo di Na in entrata in cellula è uguale a flusso netto passivo di K in uscita dalla cellula b) non si ha un trasporto netto di cariche da un ambiente all altro e il principio dell elettroneutralità delle soluzioni non è infranto nella massa delle soluzioni in gioco. Lo ione Cl nella maggior parte dei casi è distribuito all equilibrio.

21 Potenziale di membrana Le cellule sono almeno 40 volte più permeabili al K rispetto al Na In quanto una piccola quota di Na riesce ad entrare, la d.d.p. è lievemente più positiva rispetto al pot. di equilibrio del K di 90 mv P K > P Na 1 : 0.02 K Na

22 Come mai il Potenziale di membrana e le concentrazioni ioniche sono COSTANTI nel tempo? La risposta é nell'attività dell Na /K ATPasi di membrana che: 1) espellendo attivamente Na entrato passivamente e ricaptando K, mantiene costanti nel tempo le differenze di concentr. ioniche e di conseguenza indirettamente il pot di membrana K 2K La pompa Na K ATPasi genera dei controflussi attivi che controbilanciano i flusso passivi degli ioni Na e K attraverso i rispettivi canali. Na 3Na 2) essendo elettrogenica (scambia 3 ioni Na con 2 ioni K) può essa stessa generare un potenziale elettrico attivo che si addiziona a quello di diffusione di Na e K. Il contributo al potenziale di membrane derivante dalla elettrogenicità della pompa è di circa il 5%.

23 Potenziale di membrana ed equazione di Goldmann Il potenziale di membrana, essendo un potenziale di diffusione, può essere calcolato mediante l equazione di Goldmann HodgkinKatz. Dal momento che gli ioni maggiormente coinvolti nella genesi del potenziale di membrana sono gli ioni K e Na, l equazione di Goldmann può essere applicata al Na e K : D = RT ln PNa[Na]est PK[K]est zf PNa[Na]int PK[K]int Se dividiamo il numeratore e il denominatore per PK e conglobiamo il termine RT/F, l equazione diventa: D = RT ln PNa/PK[Na]est [K]est zf PNa/PK[Na]int [K]int Se consideriamo che la [Na] est = 145 mm, la [Na] int = 15 mm; la [K] est = 4 mm; la [K] int = 140mM e che la permeabilità del K è circa 40 volte maggiore della permeabilità del Na, allora: D = 58 Log (0,025) (145mM) 4mM = 58Log(0,054) = 73,4mV (0,025)(15mM) 140 mm

24 Potenziale di membrana ed equazione di Goldmann D = 58 Log (0,025) (145mM) 4mM = 58Log(0,054) = 73,4mV (0,025)(15mM) 140 mm Il valore del potenziale di membrana ottenuto è più vicino al potenziale di equilibrio del K (90mV) che a quello del Na (58mV). Se vi fosse un cambiamento di permeabilità relativa al Na e al K, l equazione di Goldmann darebbe origine ad un nuovo valore di potenziale di membrana. E da notare che se la permeabilità a uno dei due ioni è pari a zero, allora l equazione di Godmann si riduce all equazione di Nerst per l altro ione. Se la membrana è permeabile ad un solo ione, il potenziale di membrana è pari al potenziale di equilibrio di quello ione.

25 Potenziale di membrana e forza elettrochimica agente sugli ioni Poiché né il Na né il K si trovano in una situazione di equilibrio, una forza elettrochimica netta agisce su tali ioni. La seguente regola descrive la forza elettrochimica che agisce sugli ioni che permeano attraverso la membrana: La forza elettrochimica netta che agisce su uno ione tende a farlo muovere attraverso la membrana in direzione tale da avvicinare il potenziale di membrana al potenziale di equilibrio di quello stesso ione, cioè tale da portare lo ione più vicino al suo equilibrio. Quindi, quando un certo numero di ioni si distribuisce ai lati di una membrana, e tutti sono lontani dal loro equilibrio elettrochimico, ognuno tenderà a spostare il potenziale di membrana verso il suo potenziale di equilibrio (di Nernst) Più permeabile è la membrana ad un particolare ione, maggiore è la forza con cui quello ione tende a portare il potenziale di membrana verso il proprio potenziale d equilibrio

26 Potenziale di membrana e correnti ioniche Nella genesi del potenziale di membrana l afflusso di sodio è esattamente controbilanciato dall efflusso di potassio. Dal punto di vista elettrico vuol dire che: ik ik ina = 0 K Na K. e per quelle cellule con una sensibile permeabilità al cloro: ina Na ik ina icl = 0

27 Potenziale di membrana e correnti ioniche Per la legge di Ohm: i = E/R ed essendo R = 1/g i = E. g g = conduttanza dello ione che si esprime in S/cm 2 (ms o µs o ps/cm 2 ). E direttamente correlata con la permeabilità E = differenza di potenziale La forza elettromotrice che fa muovere uno ione attraverso la membrana è pari alla differenza tra il potenziale di membrana (E m ) e il suo potenziale di equilibrio (E ione ): E m E ione (di Nernst) Pertanto, la corrente di ogni singolo ione attraverso la membrana matematicamente dalla seguente relazione: può essere descritta i = g (V m E ione ) cioè i K = g k (E m E k ) e i Na = g Na (E m E Na ) e i Cl = g Cl (E m E Cl )

28 Potenziale di membrana e conduttanze ioniche Considerando Na, K e Cl, la differenza di potenziale a cavallo della membrana sarà data dalla EQUAZIONE DELLA CONDUTTANZA DI MEMBRANA: E m = g K g g Na g Cl E K E Na E Dove: g = g Cl K g Na g Cl g g g = 1/R Più la membrana è permeabile ad uno ione, maggiore è la conduttanza di membrana a quello ione Em = E Na g Na E k g k g Na g K

29 La conduttanza della membrana è una misura della facilità con cui una corrente ionica può attraversarla Le differenze esistenti tra Permeabilità e Conduttanza permeabilità elevata in presenza di pochi ioni = debole corrente ionica = G modesta K K K Permeabilità elevata in presenza di molti ioni = elevata corrente ionica = G alta K K K K K K Permeabilità e conduttanza, benché direttamente correlate, non sono la stessa cosa. La permeabilità dà una misura della velocità con cui lo ione passa la membrana. La conduttanza della membrana ad uno ione dipende sia dalla permeabilità che dal numero di ioni disponibili in soluzione.

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31 Equivalente elettrico della membrana La membrana cellulare manifesta una differenza di potenziale negativa verso il lato citoplasmatico della membrana. In termini elettrici è come se le due superfici della membrana corrispondessero ai due poli di una pila elettrica, il cui polo negativo è situato all interno della cellula e quello positivo verso l esterno. Il doppio strato fosfolipidico, impermeabile agli ioni, agendo come isolante conferisce alla membrana una capacità elettrica, pertanto può essere assimilato ad un condensatore le cui armature sono rappresentate dalle superfici della membrana rivolte rispettivamente verso il lato extracellulare ed intracellulare. N.B. La capacità del condensatore è un indice della facilità con la quale cariche separate possono essere conservate Il condensatore è l elemento di un circuito che opera da immagazzinatore e «rilasciatore» di cariche.

32 Equivalente elettrico della membrana I canali ionici attraverso cui passano le cariche elettriche dotano la membrana di una propria conduttanza elettrica. Infatti, la permeabilità del canale nei confronti dello ione può essere rappresentato da un punto di vista elettrico con un resistore ovvero con il suo inverso la conduttanza. Queste proprietà elettriche della membrana possono essere convenientemente rappresentate tramite un circuito equivalente in cui un condensatore è collegato in parallelo con una resistenza.

33 Pertanto, un canale e il gradiente di concentrazione dello ione permeante che lo attraversa possono essere rappresentati da un punto di vista elettrico come costituiti rispettivamente da un resistore e da una batteria in serie Se sulla membrana esistono più canali ciascuno selettivo per un certo ione, il circuito elettrico equivalente sarà del tipo: esterno Na Cl 1/g Na 1/g K 1/g Cl K E Na E K E Cl interno

34 Circuito elettrico equivalente di una membrana biologica che presenta le conduttanze del Na e del K. Tutte le rimanenti conduttanze sono sommate insieme come 1/g T. I gradienti di concentrazione del Na e del K Le pile di concentrazione E Na e E K sono in serie alle rispettive conduttanze e con polarità opposte extracellulare 1 1 g Na g K Cm 1 g T Vm E Na E K intracellulare