Fondamenti di spettroscopia. Spettrofotometria UV/Vis (Tecnica analitica)

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1 Fondamenti di spettroscopia Spettrofotometria UV/Vis (Tecnica analitica)

2 Spettroscopia Definizione: Lo studio della struttura e della dinamica della materia (in biologia delle molecole) attraverso l analisi dell interazione con la radiazione elettromagnetica Serve per : Identificare molecole Quantificare molecole Analizzare cambiamenti dinamici nella composizione o nella struttura delle molecole (cinetica di reazioni ) Principio : La lunghezza d onda della luce (la sua energia) determina il modo in cui questa interagisce con la materia

3 Principio : quando la luce incontra la materia parte di essa verrà modificata a seguito dell interazione

4 La Radiazione Elettromagnetica Secondo la meccanica quantistica la radiazione elettromagnetica ha una doppia natura. Essa possiede le proprietà di un onda e di un corpuscolo

5 NATURA ONDULATORIA lunghezza d onda ( ) frequenza ( ) X = c / Y Parametri di un onda: Lunghezza d onda ( ): distanza tra due massimi Frequenza ( ): numero di oscillazioni in 1 secondo (Hz = 1 ciclo/s) nel vuoto c 3x10 8 m/s. A Z Frequenza e lunghezza d'onda sono INVERSAMENTE PROPORZIONALI

6 NATURA CORPUSCOLARE Una radiazione elettromagnetica consiste in pacchetti discreti di energia, chiamati FOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l'equazione: E = h. h indica la costante di Planck: h = J. s ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTE PROPORZIONALI Questa relazione ci indica l'energia associata a ciascun fotone per ogni onda di frequenza.

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8 Una transizione avviene quando l energia di una molecola cambia da uno stato all altro L assorbimento avviene quando la radiazione causa un aumento di energia nel sistema con cui interagisce. L emissione avviene quando la radiazione è prodotta da un sistema durante una transizione da un alto livello energetico a uno più basso.

9 Principio: Quando una radiazione passa attraverso uno strato di sostanza solida, liquida o gassosa, alcune frequenze possono essere rimosse selettivamente mediante assorbimento, cioè un processo in cui l energia elettromagnetica viene trasferita agli atomi, ioni o molecole che costituiscono il campione. L assorbimento di radiazione promuove queste particelle dal loro stato normale (fondamentale) a uno o più stati eccitati ad energia più alta. Stato eccitato (E 1 ) DE = h Stato fondamentale (E 0 )

10 Secondo la teoria quantistica, gli atomi, le molecole o gli ioni possiedono soltanto un numero limitato di livelli energetici discreti; perché si abbia assorbimento della radiazione, l energia del fotone eccitante deve essere esattamente uguale alla differenza di energia fra lo stato fondamentale ed uno degli stati eccitati della specie assorbente.

11 Che accade quando una radiazione luminosa colpisce una molecola? L energia di una sorgente luminosa interagisce con le molecole in diversi modi. A livello atomico vediamo la promozione di elettroni a più alti livelli energetici. A livello molecolare si verificano transizioni elettroniche ma anche una varietà di sottolivelli energetici. Le transizioni tra livelli energetici non sono limitate agli elettroni. I legami chimici possono andare incontro a una varietà di livelli energetici vibrazionali e atomi connessi da legami covalenti possono ruotare l uno rispetto all altro.

12 Aumento dell energia microonde Infrarosso visibile ultravioletto Transizioni rotazionali Transizioni vibrazionali Transizioni elettroniche (strati esterni) 10 1 Raggi-X Diffrazione/Ionizzazione Transizioni elettroniche (strati interni)

13 spettroscopia di ASSORBIMENTO: quando atomi o molecole vengono eccitati e passano a stati energetici maggiori. Si ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizza un fascio di luce dopo che ha attraversato una sostanza. spettroscopia di EMISSIONE: dagli stati eccitati, ritornando allo stato fondamentale, le particelle riemettono energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche. Si ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizza un fascio di luce dopo che ha attraversato una sostanza.

14 Tecniche spettroscopiche Regione dei raggi g (transizioni nucleari) Mossbauer-assorbimento Regione dei raggi X (transizioni elettroniche interne) Diffrazione ai raggi X Regione UV-vis (transizioni elettroniche esterne) -Spettrofotometria (assorbimento) -Dicroismo circolare (assorbimento) -Fluorescenza (emissione) Regione dell infrarosso (transizioni vibrazionali) Assorbimento IR

15 Spettro di assorbimento Quando la luce colpisce un campione, le le lunghezze d onda con energia idonea a promuovere il salto degli elettroni dallo stato basale a quello eccitato sono rimosse dallo spettro trasmesso

16 Nella tecnica della spettrofotometria uv-vis si impiegano radiazioni nell intervallo nm, la cui energia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggio di elettroni degli strati esterni a stati eccitati UV (Ultravioletto) nm Visibile nm Energia

17 Attraverso l analisi dello spettro di assorbimento di una sostanza possiamo ricavare diverse informazioni su di essa Gli spettri di assorbimento sono misurati tramite spettrofotometri selezione di una radiazione monocromatica (a singola lunghezza d onda, i cui fotoni hanno tutti la stessa energia)

18 Vis: Lampada a incandescenza (filamento di tungsteno) UV: Lampada a scarica (ampolla con idrogeno/deuterio)

19 spettrofotometro a doppio raggio

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21 Spettro di assorbimento

22 CUVETTE VIS nm UV nm

23 Trasmittanza = T=I/I 0 Assorbanza = A=log1/T = log I 0 /I Assorbanza = A = cd (legge di Lambert-Beer)

24 Il coefficiente di estinzione molare ( ) è caratteristico di una determinata molecola ad una determinata lunghezza d onda. Poiché è definito come A = cd = A / cd si esprime in L mol-1 cm-1

25 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla profondità, d 0.22 Sorgente di luce Rivelatore

26 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla profondità, d 0.42 Assorbimento b Sorgente luminosa Rivelatore Campione

27 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla profondità, d 0.62 Assorbimento Sorgente Rivelatore campioni

28 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla profondità, d 0.82 Assorbimento Sorgente Rivelatore Campioni

29 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla concentrazione, c 0.22 Sorgente Rivelatore

30 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla concentrazione, c 0.42 Assorbimento b Sorgente Rivelatore Campione

31 La legge di Lambert-Beer A = cd Dipendenza dalla concentrazione, c 0.62 Assorbimento b Sorgente Rivelatore campione

32 Spettro di assorbimento

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34 Applicazioni degli spettri di assorbimento Misure Quantitative determinazione di concentrazioni Calcoli di velocità di reazioni Studi strutturali folding, assemblaggio, denaturazione, cambiamenti di struttura, legame di ligandi Enzimatici - Ad es. analisi degli intermedi delle reazioni Identificazione di composti (vitamine, ormoni). Utile per identificare proteine con cromofori particolari Studi immunologici (ELISA)

35 Molte sostanze (molecole) sono intrinsecamente colorate (assorbono la luce) a causa della presenza di gruppi cromofori I cromofori nelle proteine The peptide bond

36 Gli aminoacidi aromatici assorbono nell UV

37 I gruppi cromofori nelle proteine max (nm) (M -1 cm -1 ) legame peptidico: triptofano: tirosina: fenilalanina:

38 Cosa determina l assorbanza di un cromoforo? I cromofori sono di solito caratterizzati da doppi legami e sistemi di risonanza Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente determinato dalla sua natura chimica L ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello spettro - ph - polarità del solvente - effetti di orientamento I cromofori possono agire da molecole reporter che possono dare informazioni circa il loro ambiente. Effetti di protonazione/deprotonazione dovuti a cambiamenti di ph o effetti di ossidazione/riduzione influenzano la distribuzione elettronica dei cromofori Polarità del solvente. Gli spettri cambiano in differenti solventi. Effetti di orientamento derivano da molecole di cromofori vicini. Ad es. ipercromia degli acidi nucleici.

39 Spettro di assorbimento dell emoglobina

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42 Però NADH libero o legato ha assorbimenti ( ) diversi Si può titolare il sito dell enzima misurando DA

43 Un estesa coniugazione ha un grande effetto sulla max ; lo spostamento sarà verso lunghezze d onda maggiori H H H H 1,3-butadiene C C C C H H H H C C H H max 170 nm max 217 nm

44 H H C C H C C H H H max 217 nm (diene coniugato) H 3 C H C C H C C H H max 263 nm triene coniugato H C C H CH 3

45 I pigmenti fotosintetici assorbono la luce perché hanno sistemi di doppi legami coniugati

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47 Spettri differenziali e perturbazioni del solvente Cambiamenti nella lunghezza d onda della banda di assorbimento possono essere indicativi di cambiamenti nella struttura. L uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenere informazioni sulla struttura della proteina, e studiare i suoi cambiamenti conformazionali

48 Spettroscopia differenziale

49 A292 A or E A292 nativa Urea 0.01M NaCl λ temp 0.1M NaCl temp Spettri di proteine native o denaturate possono essere usati per studiare le cinetiche di denaturazione/rinaturazione La stabilità delle proteine in diversi tamponi può essere studiata in diversi tamponi misurando il suo unfolding in funzione della temperatura

50 A Effetti di protonazione deprotonazione OH ph 6 O - ph 13 CH 2 CH NH 3 + CH 2 CH NH λ

51 Effetti di ossidazione e riduzione C 3 m 4 N N Fe N N c a b d O O O O

52 Se il prodotto di una reazione è un cromoforo, è possibile usare la spettroscopia di assorbimento elettronico per studiare la cinetica enzimatica A tempo