4) PROTEINE FERRO ZOLFO. Contengono Fe e S in quantità equimolecolari; fanno parte dei complessi respiratori. La NADH DH contiene diversi centri Fe-S.

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1 4) PROTEINE FERRO ZOLFO Contengono Fe e S in quantità equimolecolari; fanno parte dei complessi respiratori. La NADH DH contiene diversi centri Fe-S. Trasportano elettroni attraverso le transizioni Fe 2+ Fe 3+ Esistono complessi : Fe-S 2Fe-2S 4Fe-4S Hanno potenziali red-ox varianabili (dipendono dalla proteina in cui sono inseriti) in un ambito notevole (-0.49 V, +0.22V). Le forme Fe 3+ sono rosse o verdi; in seguito a riduzione subiscono un parziale sbiancamento. Nella catena respiratoria mitocondriale (da NADH a O 2 ) ci sono almeno 10 diversi centri Fe-S individuabili per mezzo della risonanza di spin elettronico (EPR). 5-8 nel complesso NADH DH 2 associati al cit b 1 associati al cit c1 Nelle proteine Fe-S di Rieske l atomo di Fe è coordinato da due residui di His.

2 da: Nelson & Cox Fe-S 2Fe-2S 4Fe-4S

3 5) CITOCROMI Proteine in grado di trasportare elettroni, presenti solo in cellule aerobie; contengono EME = gruppi ferro-porfirine (come anche le globine, catalasi e perossidasi). Localizzati: Membrana mitocondriale interna Reticolo endoplasmico (reazione di idrossilazione b5) Trasportano elettroni :subiscono transizioni Fe 2+ catalitici. Fe 3+ durante i cicli In mitocondri animali: cit b E 0 dipende dalla proteina cit c 1 cit c cit a cit a 3 unico ad essere ossidato direttamente da O 2 (contiene anche Cu)

4 Legato covalentemente da: Nelson & Cox coda isoprenoide

5 EME : PORFIRINA IX = anello tetrapirrolico + sostituenti laterali (4 metili, 2 vinili, 2 propionati) SOLO nel cit b (come Hb e Mb);negli altri citocromi altre protoporfirine Fe2+ :quattro legami di coordinazione Fe-N; quinta e sesta posizione perpendicolare al piano della porfirina: nelle GLOBINE 5a gruppo imidazolico di His F8 nei CITOCROMI 6a 5 libera a e 6 a per posizione O 2 occupate da gruppi R di amminoacidi. Solo a 3 può legare O 2 nella sua funzione biologica. Globine trasportatori di O 2 Fe 2+ Citocromi trasportatori di elettroni Fe 2+ Fe 3+ Il cit c è l unico in cui l EME è legato covalentemente alla proteina. I citocromi sono legati saldamente alla membrana mitocondriale interna, è difficile ottenerli in forma solubile e omogenea, tranne il cit c che è facilmente estraibile con soluzioni saline concentrate.

6 α, β, γ, bande di Soret da: Nelson & Cox

7 Ciascun citocromo ha, nel suo stato ridotto, tre bande di assorbimento caratteristiche nel visibile, α, β, γ. Valori (nm) delle principali bande di assorbimento nello spettro visibile dei citocromi ridotti EMOPROTEINA Banda di assorbimento Banda di assorbimento Banda di assorbimento α β γ Cit c Cit b Cit a ossiemoglobina Cit bh (α = 562) e cit bl (α = 566)

8 La SEQUENZA dei centri ossidoriduttivi nella catena respiratoria

9 La SEQUENZA della catena respiratoria è stata stabilita: 1) in base ai potenziali red-ox dei vari componenti: COMPONENTI NAD + /NADH NADH DH (FMN)/NADH DH (FMNH 2 ) FAD/FADH Q/QH Cit b +3 /cit b Cit c 1 +3 /cit c 1 +2 Cit c +3 /cit c Cit a +3 /cit a Cit a 3 +3 /cit a 3 +2 ½ O 2 /H 2 O E 0 (volt) Gli elettroni passano dalla coppia redox con tendenza più forte a cedere elettroni, E 0 negativo, a quella con tendenza meno forte,e 0 positivo.

10 2) in base ad esperimenti di ricostruzione in vitro con trasportatori di elettroni isolati: es. NADH può ridurre solo la NADH DH (FP1) ma non può ridurre direttamente i cit b, c o aa 3. O 2 può ricevere elettroni solo da cit aa 3 e non altri.

11 3) In base allo stato di ossidoriduzione dei singoli componenti durante il loro funzionamento in mitocondri intatti utilizzando lo spettrofotomentro differenziale. Quando i mitocondri isolati ossidano intermedi del ciclo di Krebs gli spettri mostrano che il trasportatore di elettroni più vicino all estremità riducente della catena in condizioni aerobie è il membro più ridotto della catena, mentre il cit aa 3 (più vicino all O 2 ) è quasi tutto in forma ossidata. I trasportatori intermedi si trovano in uno stato di riduzione decrescente, via via che si va verso l O 2.

12 SPETTROFOTOMETRIA DIFFERENZIALE registra direttamente lo spettro della differenza di assorbimento delle forme ossidate e ridotte A Spettro del FAD/FADH 2 ox red

13 SUBSTRATI 100 % riduzione 50 ANALOGO IDRAULICO in condizioni di equilibrio dinamico aerobio 0 NAD FP b c a.... : : O 2 In condizioni anaerobie il sistema è tutto pieno se vengono ossidati intermedi. Appena si fornisce O 2 il primo componente ad ossidarsi (cit aa 3 ) sarà il più vicino a O 2 e poi via via tutti gli altri in ultimo si ossida l NADH. In condizioni aerobie e in mancanza di substrati il sistema è tutto vuoto (tutti i componenti sono ossidati). Appena si fornisce un substrato (es. acido malico) il primo componente a ridursi è l FMN della FP1, cioè il più vicino all NADH, poi via via tutti gli altri.

14 4) uso degli inibitori del trasporto degli elettroni. ROTENONE sostanza vegetale estremamente tossica usata dagli Indios come veleno per i pesci. Oggi impiegata come insetticida. AMYTAL un barbiturico PIERICIDINA antibiotico simile all UQ, può competere con esso ANTIMICINA A isolata dallo Streptomyces griseus ACIDO CIANIDRICO, ACIDO SOLFIDRICO, CO. Il loro punto di azione è stato scoperto tramite gli esperimenti di CROSSOVER di B. Chance, utilizzando gli spettri di assorbimento dei composti ossidati e ridotti. L aggiunta di un inibitore varia la proporzione tra la forma ossidata e ridotta di ciascun carrier, rispetto alla situazione di equilibrio aerobio.

15 SUBSTRATI 100 % riduzione 50 l aggiunta di Anticimina A fa diventare più ridotti i carrier tra NADH e cit b e più ossidati quelli tra i cit c e O 2 inibisce il trasporto tra b e c1 essendo questo il punto di incrocio. 0 NAD FP 1 b c a ROTENONE,un insetticida AMYTAL, un barbiturico PIERICIDINA,un antibiotico, blocco da Antimicina A inibiscono la NADH DH tra FeS e ubichinone) ANTIMICINA A blocca tra b e c1 CIANURO H 2 S bloccano il trasporto tra cit aa 3 e O 2. CO

16 da: Nelson & Cox