La mutazione c.34g>t del gene KRAS come marcatore precoce delle poliposi associate al gene MUTYH

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1 Tumori Ereditari : dalla biologia molecolare al trattamento Modena, Novembre 2010 La mutazione c.34 del gene KRAS come marcatore precoce delle poliposi associate al gene MUTYH Tiziana Venesio, Antonella Balsamo, Francesca Rovetto, Marianna Cerni, Carmela Di Gregorio* e Mauro Risio Patologia Molecolare, Anatomia Patologica, IRCC Candiolo, Torino *Anatomia Patologica, Policlinico di Modena

2 La carcinogenesi di MUTYH puo essere rapida Lipton et al, Cancer Res, 2003 MUTYH inattivato costitutivamente Danno Ossidativo Fissazione di trasversioni su geni target Nei tumori MAP il gene target piu frequentemente mutato è KRAS Il 40% di questi carcinomi presenta su KRAS la trasversione c. 34

3 Nella progressione adenomacarcinoma KRAS determina il passaggio ad adenoma intermedio Walther et al., Nat Rev Cancer, 2009 Negli adenocarcinomi sporadici del colon la mutazione su KRAS è identificata nel 50% dei casi Neumann et al., Pathol. Res. Practise, 2009 c.34 è rara nei carcinomi del colon-retto sporadici

4 SCOPO La mutazione c.34 può essere considerata come marcatore molecolare precoce e specifico di poliposi associata a MUTYH (MAP)? Contribuisce a determinarne il fenotipo? A che livello della progressione si fissa? PAZIENTI E METODI 11 Pazienti MAP 40 adenomi + 5 tumori + 1 metastasi 14 pazienti FAP 30 adenomi + 3 tumori 103 pazienti sporadici 25 polipi + 52 tumori + 26 metastasi Materiale fissato Dissezione al microscopio ottico Estrazione DNA Sequenziamento diretto KRAS / BRAF Analisi con pyrosequencing

5 Mutazioni di KRAS/BRAF negli adenomi KRAS 11 pazienti MAP : 40 adenomi BRAF 11/36 mutazioni (30%) Codone % 0/29 mutazioni (0%) Codone G>A 2 38G>A 36% 1 37G>C 14 pazienti FAP : 30 adenomi 5/27 mutazioni (18,5%) 1/20 mutazioni (4%) Codone G>A 25 pazienti sporadici : 25 adenomi 5/25 mutazioni (25%) Codone Codone G>A 1 35G>A

6 Mutazioni di KRAS/BRAF nei tumori KRAS BRAF 11 pazienti MAP : 5 primitivi e 1 metastasi 5/6 mutazioni (83%) Codone % 3/5 mutazioni (60%) V600E 100% 14 pazienti FAP : 3 tumori 2/3 mutazioni (30%) Codone 12 35G>A 0/3 mutazioni (0%) 78 pazienti SPORADICI : 52 tumori primitivi + 26 metastasi Tumori : 25/52 mutazioni (46%) Codone G>A (45%) (26%) Metastasi: 12/26 (48%) Codone G>A (18%) 1 38 G>C (2,6%) 2 35 G>C (5%) 1 34 (2,6%)

7 Quantificazione con pyrosequencing delle mutazioni KRAS/BRAF : adenomi MAP e FAP Adenomi MAP Adenoma Mut KRAS % Mut CG p1 Cod % CG p2 Cod 13 38G> A 36% CG p3 Cod 13 38G> A 45% CMC p1 Cod 13 37G> A 15% FL p1 Cod % Adenomi FAP Adenoma Mut KRAS % Mut FP p1 Cod % MM p1 Cod 12 35G>A 25% AR p1 Cod 12 35G> A 10% FL p2 Cod % FL p3 Cod % FL p4 Cod % Cod G>A 18% LB p1 Cod % GA p1 Cod 13 38G>A 10% BA p1 Cod 13 38G>C 5% Adenoma Mut BRAF % Mut RP p1 V600E 10% Cod = 23,5% Cod 13 38G>A 38G>C 37G>A 18,5%

8 Quantificazione con pyrosequencing mutazioni KRAS/BRAF : tumori MAP e FAP Tumori MAP Tumori Mut KRAS % Mut Mut BRAF % Mut CG t1 Cod % V600E 16% CG t2 Cod % V600E 12% Cod = 36,7% V600E = 14,3% FL t1 Cod % V600E 15% Tumori FAP Tumori Mut KRAS % Mut Mut BRAF % Mut CRM t1 Cod 12 35G>A 45% CRM t2 Cod 12 35G>A 15% Cod 12 35G>A = 30%

9 Correlazione genotipo-fenotipo Gruppo A: pazienti con KRAS 34 FL Carcinoma A FL Metastasi CG Carcinoma B CG-Adenoma C Ca-Carcinoma Ca Adenoma C3 FL Adenoma B2 CG-Adenoma B G>A cod13 FL Adenoma B3 FL Adenoma B5 FL Adenoma B5 FL Adenoma B4 CG-Adenoma E CG-Adenoma A CG-Adenoma D CG-Adenoma E G>A cod13 Gruppo B: pazienti senza KRAS 34 CMC- Adenoma A G>A cod 13 CMC- Adenoma B1 CMC- Adenoma B2 BL Adenoma P4 G>C cod 13 BL Adenoma P1 BL Adenoma P2 FM Adenoma C1 / FM Adenoma C2 / FM Adenoma C3 / CMC- Adenoma B3 CMC-Adenoma B4 CMC-Adenoma C BL Adenoma P3 BL Adenoma P3 Gas Adenoma 1 / Gas Adenoma 2 / Gas Adenoma 3 /

10 1. Gli adenomi MAP e FAP con mutazione su KRAS e BRAF sono stati microdissettati al laser per separare componenti a differente grado di trasformazione 2. Le diverse componenti sono state sottoposte ad analisi mutazionale di KRAS e BRAF con pyrosequencing utilizzando un protocollo nested dedicato per microsampling di lesioni in FFPE Dufort et al., Analytical Biochemistry, 2009

11 Analisi pyrosequencing diverse componenti morfologiche degli adenomi microdissettati Campione MAP 3. Pyrosequencing microdissezione FL-B3 1.Sequenziamento Componente normale 7% allele mut Componente con basso grado di displasia 15 % allele mut 2. Pyrosequencing tot. c.34 = 30% Componente con alto grado di displasia 26% allele mut

12 CONCLUSIONI La mutazione c.34 può essere utilizzata come marcatore molecolare specifico di MAP presente nel 20% degli adenomi. In queste lesioni la percentuale di allele mutato c.34 e ca. 23 %. Tale percentuale aumenta nei carcinomi, ma in modo proporzionale rispetto agli adenomi I pazienti con carcinoma presentano adenomi mutati per c.34 La quantizzazione di c.34 nelle lesioni microdissettate indica che questa mutazione compare molto precocemente durante la progressione (cellule normali- displasia di basso grado)