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1 Acondroplasia Anemia Falciforme Lezione 4

2 Diagnostica I le informazioni sulle malattie sono reperibili oltre che come PDF anche direttamente al sito

3 Acondroplasia Velazquez

4 Acondroplasia I Il gene coinvolto in questa patologia e FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor-3), che mappa in 4p16.3 (telomero del cromosoma 4), contiene 19 esoni, e lungo 16.5 Kb ed e l unico le cui mutazioni siano state collegate all acondroplasia. Il recettore ha 3 domini Ig-like, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico tirosinochianasico Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo configurare come aumento di funzione

5 considerazione importante Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo configurare come aumento di funzione MBisogna sempre ricordare che la dominanza attiene al fenotipo e quindi e l effetto della mutazione sulla funzione del prodotto che provoca la dominanza del fenotipo mutato sul wildtype. Quindi l effetto della mutazione dipende da: quale e la funzione del wt: e sensibile alla dose sia in piu che in meno? e quindi: la mutazione provoca un aumento o una diminuzione dell attivita del prodotto? MQuesto vale per tutti i geni e i loro prodotti!!!

6 Acondroplasia II L acondroplasia e una patologia originata ad un anormale sviluppo osseo. E una patologia autosomica dominante, oltre l 80% degli affetti hanno genitori con statura normale e sono originati da una mutazione de novo, quindi il rischio di ricorrenza e basso (attenzione al mosaicismo germinale) Nel caso di una coppia in cui uno dei partner sia affetto, il rischio di ricorrenza e 50%, se entrambi sono affetti: 25% non affetti, 50% affetti, 25% letali per l omozigosi. Sembrerebbe collegata con aumentata eta paterna, proprio per il relativamente alto tasso di nuove mutazioni. Il mosaicismo germinale sembra essere la causa delle rare famiglie con ricorrenza Perche la diagnosi molecolare? per confermare un sospetto diagnostico per una diagnostica prenatale ( mosaicismo germinale)

7 Acondroplasia III Analisi di mutazioni note: sono note 2 mutazioni patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina con una arginina nel dominio transmembrana G380R. Nel 98% e una transizione G>A nell 1% e una trasversione G>C il restante 1% puo essere dovuto ad altri alleli rari: G>T codone 375 glicina>cisteina A>G codone 650 lisina> glutamina (letale:nanismo thanatoforo) Per tutte la... tecnica e la ARMS o analoghe: la sequenza wt e mutata sono note. E se non ci sono le mutazioni note? e si deve fare una diagnosi prenatale? By NA

8 Test per mutazioni note Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS (Amplification Refractory Mutation System): si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo in 2 provette in una i primer sono entrambi per la sequenza normale, nell altra un primer e un ASO specifico per la mutazione. Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano. Di solito il test e multiplex utilizzando primer che permettano di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.

9 Acondroplasia IV Sequenziamento tenendo presente che se si trova una mutazione: Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e noto): e presente in altri soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e accertato essere innocuo sulla funzionalita (come?)

10 Acondroplasia V Sequenziamento: si e risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi non si e trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire? Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione ad un altro locus, Diagnosi errata o il prodotto del secondo ipotetico locus interagisce con il primo e quindi il fenotipo e uguale Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione non visibile perche si manifesta durante la maturazione dell RNA. E quindi che faccio? Nel caso dell acondroplasia l ecografia prenatale mi aiuta e non e il caso di ricorrere al linkage perche non esistono portatori silenti : la penetranza e totale e non c e espressivita variabile.

11 Acondroplasia VI

12 Acondroplasia VII

13 Anemia falciforme Lezione 3

14 cos e l anemia falciforme La falcemia e una forma di anemia caratterizzata, oltre che da emolisi da episodi di occlusione dei vasi sanguigni con conseguente ischemia dei tessuti e danni agli organi (l occlusione e legata alla tendenza alla falcizzazione dei globuli rossi e alla loro scarsa elasticita dovute alla tendenza delle catene mutanti ad aggregarsi, per cui i globuli rossi non riescono a passare nei vasi periferici) l occlusione si accompagna ai dolori delle estremita. La maggior parte degli affetti non hanno segni clinici evidenti alla nascita e cominciano a manifestare i primi segni nell infanzia e nella fanciullezza (perche?)

15 Genetica dell anemia falciforme Si trasmette come autosomica recessiva se si considera il fenotipo sistemico dell individuo, se consideriamo il fenotipo del globulo rosso e dominante, perche gli eterozigoti presentano la falcizzazione anche se sono asintomatici La patologia e legata alla presenza dell emoglobina S (HbSS) in cui le catene beta sono mutate al codone 6 dove un acido glutammico viene sostituito da una valina. Questa mutazione e presente praticamente in tutti gli affetti che sono pertanto dei veri omozigoti. L incidenza varia da popolazione a popolazione, ma come altre patologie del globulo rosso e piu frequente nelle regioni malariche, in Africa e molto frequente: nati vivi l anno

16 Genetica dell anemia falciforme Una statisca USA riporta: Il 60-70% degli affetti hanno la anemia falciforme Hb SS, in cui sono presenti due alleli S Altri affetti hanno forme varianti legate alla presenza di un allele S e di altri alleli patologici, cioe sono eterozigoti composti La forma piu frequente di questo gruppo e l anemia falciforme-emoglobina C: Hb SC Seguono due forme di anemia falciforme-thalassemia : HbS e HbS Altre forme sono dovute alla presenza oltre che dell allele S, di alleli come D-Punjab o O-Arab (il nome di questi alleli indica chiaramente che sono presenti in gruppi etnici distinti)

17 Allelia multipla nell anemia falciforme Il gene HBB mappa in 11p15 nel cluster delle globine non-alfa(cfr Gen.II), ha molti alleli anche solo polimorfici, e la sua funzione vi e piu che nota. Per quello che riguarda l anemia falciforme: Allele S : e presente una sostituzione del secondo nucleotide del sesto codone, mutazione E6V Acido glutammico > Valina Allele C: e presente una sostituzione del secondo nucleotide del sesto codone, mutazione E6K Acido glutammico > Lisina Allele D-Punjab e presente una sostituzione al codone 121, mutazione E121Q Acido glutammico >Glutammina Allele O-Arab e presente una sostituzione al codone 121, mutazione E121K Acido glutammico >Lisina Alleli Thalassemici

18 Perche HbSS e patologica Nella emoglobina deossigenata una interazione fra la valina e le regioni complementari delle molecole vicine puo indurre la formazione di polimeri che si aggregano e alterano la forma del globulo rosso, rendendolo fragile e poco flessibile.

19 Consulenza genetica Bisogna tenere presente che se e vero che la maggior parte degli affetti ha 2 alleli S, non si deve trascurare la possibilita che siano eterozigoti composti o che uno dei genitori lo sia e sia asintomatico. Infatti in alcune popolazioni gli alleli patogenetici possono essere presenti con frequenza elevata. Quindi il rischio di ricorrenza o di essere portatori per i fratelli dipende dal genotipo del probando e dei genitori.

20 consulenza genetica I genitori del probando (primo individuo studiato in una famiglia) affetto genericamente da Anemia Falciforme possono essere: Portatori sani perche entrambi eterozigoti per l allele S (wt/s), se ci troviamo di fronte ad un malato HbSS Portatori sani perche ognuno e eterozigote per una diversa mutazione patogenetica della catena se il probando e un eterozigote composto per es. HbS o Hb SC un genitore potrebbe essere eterozigote wt/s e l altro omozigote SS o eterozigote composto Entrambi omozigoti HbSS o eterozigoti composti Quindi i fratelli:

21 consulenza genetica Se entrambi i genitori sono portatori sani e quindi eterozigoti per una mutazione del gene della catena, al momento del concepimento: 25% affetti, 50% portatori sani di una delle mutazioni presenti nei genitori, 25% non portatori e quindi wt/wt. I fratelli gia nati e non affetti hanno 2/3 di probabilita di essere portatori Se un genitore e eterozigote wt/s e l altro omozigote SS o eterozigote composto, ciascun fratello prima del concepimento ha 50% di probabilta di essere affetto e 50% di essere portatore sano e quindi wt/m. Fratelli gia nati e non affetti 100% portatori. Se i genitori sono entrambi omozigoti HbSS o eterozigoti composti, 100% affetti.

22 Diagnosi La diagnosi molecolare e relativamente semplice dal momento che le mutazioni sono poche e ben caratterizzate. La PCR con le sue varianti sono la tecnica d elezione.la ricerca quando e presente un allele betathalassemico (lo si vede dall alterato rapporto alfa/beta) e complicata dall elevato numero di questi alleli Naturalmente una volta identificati gli alleli patogenetici presenti nella famiglia si puo fare la diagnosi prenatale e/o preimpianto Tuttavia puo capitare che non si trovi la mutazione e allora si sequenzia, con le difficolta gia illustrate:

23 Sequenziamento Sequenziamento tenendo presente che se si trova una mutazione: Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e noto): e presente in altri soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e accertato essere innocuo sulla funzionalita (come?)

24 Sequenziamento Sequenziamento: si e risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi non si e trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire? Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione ad un altro locus, Diagnosi errata o il prodotto del secondo ipotetico locus interagisce con il primo e quindi il fenotipo e uguale Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione che non e visibile perche si manifesta durante la maturazione dell RNA.

25 NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 25