ενζυµον ( nel lievito ): un po di storia...

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1 ENZIMI CATALISI ENZIMATICA. Meccanismo d azione degli enzimi; Energia dl attivazione; Componenti strutturali e funzionali; Nomenclatura e classificazione; Specificità dl substrato ed azione; Modello Lock and Key; Coenzimi principali; Principio di additività dell energia libera in reazioni accoppiate. ενζυµον ( nel lievito ): un po di storia... Nell antichità, denominati fermenti Diastasi del malto idrolizza l amido più velocemente dell acido solforico 1835: Prima teoria della catalisi chimica (Berzelius) 1860: Fermentazione causata da sostanze termolabili (Pasteur) 1877: Primo uso del termine enzima 1897: Estrazione dal lievito degli enzimi della fermentazione alcolica, dimostrazione che può avvenire in assenza di cellule integre (Buchner) 1913: Equazione di Michaelis-Menten, primo modello matematico del funzionamento degli enzimi 1926: Cristallizzazione di ureasi (Sumner) 1930: Cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono proteine (Northrop) 1965: Teoria dell allosterismo (Jacob, Monod, Changeaux) 1992: L attività degli enzimi può essere regolata con modificazioni covalenti (Fischer, Krebs) 1997: Anche RNA può agire come catalizzatore: non tutti gli enzimi sono proteine 2004: Ruolo dell ubiquitina nella distruzione degli enzimi (Ciechanover, Hershko, Rose) 1

2 Alcune caratteristiche della materia vivente Composta da molecole non viventi, vale più della somma delle sue parti (1+1=3) Si presenta con poche differenze in specie diverse Ogni componente con funzione specifica e insostituibile, più funzioni per ciascun componente Trasforma l energia derivata dall ambiente costruendo strutture ordinate e complesse da materiale disordinato e semplice Abilità di autoriprodursi in modo preciso utilizzando le informazioni contenute nel proprio interno Capacità evolutiva, irritabilità ed adattamento all ambiente Resa ottimale: Svolge solo le reazioni necessarie minimizzando la produzione di prodotti di scarto Impedisce reazioni indesiderate prevenendo il dispendio energetico Porta a termine le reazioni in tempi brevi E indipendente dalle condizioni ambientali (temperatura, pressione) Può riutilizzare la stessa macchina per molte volte Energia di attivazione Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X Conversione X Y termodinamicamente favorevole Ma la reazione non può avvenire se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell energia di attivazione 2

3 Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia Numero di molecole Aumento di temperatura Energia di attivazione Molecole con energia maggiore dell energia di attivazione Energia Presenza di un catalizzatore Energia Energia di attivazione A Stato iniziale Riduzione dell energia di attivazione del substrato mediante: Combinazione transitoria col substrato Stabilizzazione dello stato di transizione Inserimento di numerosi stati di transizione con livello energetico inferiore Energia di attivazione senza catalizzatore P Stato finale Energia di attivazione con catalizzatore Energia liberata dalla reazione 3

4 Un enzima immaginario: la metallasi La barretta deve essere piegata prima di essere rotta (stato di transizione) Enzima con alta affinità per il substrato: stabilizza il substrato Enzima con alta affinità per lo stato di transizione: stabilizza lo stato di transizione e accelera la reaziuione Enzimi: catalizzatori biologici Non modificano l equilibrio della reazione, ma solo la velocità con la quale l equilibrio viene raggiunto Non vengono modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione 4

5 H 2 O 2 e catalasi 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Catalizzata da catalasi Reazione spostata a destra (K eq alta) ma molto lenta (k velocità bassa) DNA RNA ribosomi Struttura generale degli enzimi Zimogeno (precursore) Substrato Prodotto Apoenzima Parte non-proteica ione metallico o coenzima Sito attivo ENZIMA ATTIVO Sito allosterico Ubiquitina Lisosomi degradazione Effettore allosterico 5

6 Nomenclatura degli enzimi Denominazione classica costituita da 3 parti: Nome del substrato Nome del coenzima Nome della reazione catalizzata + asi Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin: 77 membri, presidente attuale Angelo Azzi Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi: Creatin kinasi: EC , adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC , lattato : NAD+ ossidoreduttasi Ha funzionato bene fino agli anni 90 (circa 3200 enzimi) Progetto genoma umano (HUGO): Esistono circa 20,000 geni, in buona parte enzimi Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH 2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH 2 o NADPH agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme 6

7 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 2.1 gruppi ad una unità di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 3.1 legami esterei 3.2 legami glicosidici 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C 7

8 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi 8

9 Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi 6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi 9

10 Modello Lock and Key: l enzima si combina chimicamente col substrato Emil Fisher 1894 Il sito attivo è costituito dal negativo del substrato Si formano legami esatti fra enzima e substrato Riconoscimento anche tridimensionale Esempio: glicerol kinasi (lega solo il glicerolo in forma alfa) Può distinguere stereoisomeri D- e L- degli aminoacidi Spiega la specificità, ma NON spiega la stabilizzazione dello stato intermedio Un modello più sofisticato: induced fit + substrate strain Daniel Koshland 1958 (University of California Berkeley) Sito di legame non completamente pre-formato L interazione fra substrato e enzima induce un cambiamento conformazionale nell enzima che prelude ad un legame più stabile col substrato (induced fit) Il substrato è forzato verso la formazione dei prodotti (substrate strain) 10

11 Il legame enzima-substrato avviene tramite l interazione delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito attivo Esempio: proteasi a serina Alterazioni della struttura primaria di un enzima possono mutarne l attività causando malattie genetiche Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nell enzima Esempio: esochinasi senza e con glucosio 11

12 Il cambiamento conformazionale forza il substrato ad assumere una nuova struttura o conformazione Esempio: lisozima, che idrolizza i polisaccaridi Dalla sequenza degli aminoacidi alla struttura delle proteine Struttura primaria (sequenza degli aminoacidi) Sempre lineare Struttura secondaria (conformazione della catena) α-elica o β-a pieghe Struttura terziaria (tridimensionalità della catena) Relazioni locali o remote dei gruppi R Proteine globulari o fibrose Struttura quaternaria (interazioni fra più catene) 12

13 Struttura primaria e mutazioni genetiche Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone o domini della proteina con altre molecole o parti di molecola: Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpo-antigene Il dominio preposto al riconoscimento e la molecola da riconoscere devono essere complementari in termini di struttura e di carica Il riconoscimento dipende dalla distribuzione dei gruppi R e dalla sequenza degli aminoacidi Una mutazione della struttura primaria può impedire o rendere difficile il riconoscimento, causando disfunzioni più o meno gravi Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa il dominio di riconoscimento Se la mutazione è silente (non genera malattie o disfunzioni), è possibile che l'aminoacido mutato non sia nel dominio di riconoscimento Spesso è sufficiente la mutazione di un solo aminoacido Tutte le malattie causate da tali mutazioni sono genetiche Tutte le malattie genetiche originano una mutazione della struttura primaria delle proteine Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l enzima ne favorisce una sola Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate (ad es: A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il flusso unidirezionale di materiale 13

14 Coenzimi Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamine Si legano all enzima Spesso fungono da secondo substrato Determinano la specificità della reazione catalizzata Adenosin trifosfato (ATP) Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substrato Esempio: Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP In molte chinasi, il substrato vero è Mg-ATP 14

15 Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD + ) Coenzima di deidrogenasi Derivato da niacina Trasferisce un protone da/a substrati: lattato + NAD + piruvato + NADH + H + Esiste una forma fosforilata NADP + Flavina adenina dinucleotide (FAD) Coenzima di deidrogenasi Derivato da riboflavina (vit. B 6 ) Trasferisce due protoni da/a substrati Succinato + FAD Fumarato + FADH 2 15

16 Coenzima A Trasportatore e attivatore di gruppi acilici (acidi grassi) e di acetato Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn ) Cofattori più che coenzimi Presenti in 2/3 degli enzimi Agiscono come stabilizzatori della proteina e come donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i citocromi 16

17 CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE Ordine di reazione; Ipotesi per l azione degli enzimi; Equazione di Michaelis-Menten; Velocità massima e KM; Trasformazione di Lineweaver-Burk; Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche. Cinetiche chimiche (A P) 17

18 [prodotto] Effetto della concentrazione di A (A P) A4 > A3 > A2 > A1 Velocità iniziale A4 A3 A2 A1 Tempo A1 A2 A3 A4 [A] Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche Velocità iniziale Cinetica enzimatica Cinetica chimica [A] 18

19 Ipotesi per l azione degli enzimi [S] >> [E] E + S ES EP E + P L enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che induce la formazione di P (reazione relativamente lenta) L enzima rilascia P e torna nello stato iniziale La velocità globale è regolata da [ES] Ordine di reazione Primo ordine A P v=k[a] 1, n=1 Secondo ordine A + B P v=k[a] 1 [B] 1, n=2 Pseudo primo ordine A + B P v=k[a] 1 [B] 1, n=2 ma se [B]»[A], v=k[a] 1, n=1 Ordine zero v=k, n=0 v dipende dalla concentrazione del catalizzatore 19

20 Interazione enzima-substrato v 0 V max Se [S] è molto alto, v 0 non cambia all aumentare di [S] Ordine 0 Ordine misto 1 ordine Se [S] è alto, v 0 è controllata da [E] Se [S] è intermedio, v 0 è controllata sia da [S], sia da [E] Se [S] è basso, v 0 è controllata da [S] [substrato] Commission on Enzyme Nomenclature of the International Union of Biochemistry Attività enzimatica: moli di substrato convertito per unità di tempo in condizioni standard di temperatura, ph e forza ionica: 1 katal = 1 mol/s 1 IU = 1 micromole/min Attività specifica: attività enzimatica per mg di proteina (moli/tempo/mg proteina) Espressione di purezza Costante catalitica o numero di turnover: attività enzimatica per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima) 20

21 Equazione di Michaelis-Menten (1913) v 0 = V max [S] K M +[S] Leonor Michaelis & Maud Menten Leonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 New York, October 8, 1949). Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 July 26, 1960), among the first women in Canada to earn a medical doctorate. At that time women were not allowed to do research in Canada, therefore she decided to do research in other countries such as the United States and Germany. Accomplished musician and painter. Assunzioni di Michaelis-Menten E + S ES E + P 1 solo substrato Fattore limitante: formazione di ES Tutto E ES Non esiste E libero E saturo di S ES stazionario 21

22 Ipotesi v 0 =V max /2 K M = [S] quando v 0 =V max /2 E una concentrazione (dimensioni moli/litro) E indipendente da [E] v 0 = V max [S] K M + [S] V max 2 = V max [S] K M + [S] 1 2 = [S] K M + [S] K M + [S] = 2 [S] K M = [S] Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche v 0 V max V max /2 K M [S] 22

23 Trasformazione di Lineweaver-Burk v 0 = V max [S] K M +[S] Y 1 = K M + [S] v 0 V max [S] 1 v 0 = K M V max [S] + 1 v 0 = K M V max [S] V max [S] 1 [S] + 1 V max X Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1 v 0 = K M V max 1 [S] + 1 V max 1/v 0 1/V max -1/K M 1/[S] 23

24 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche Grafico di Lineweaver-Burk V 0 1/V 0 V max V max /2 1/V max K M [S] -1/K M 1/[S] Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK) Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP [glucosio] in sangue: 5 mm [glucosio] intracellulare: mm Muscolo: HK Inibita da Glucosio-6-fosfato Utilizzo di glucosio indipendente da [glucosio] in sangue Epatociti: GK Non inibita da Glucosio-6-fosfato Trasformazione di glucosio in glicogeno dipendente da [glucosio] in sangue Pancreas: GK Non inibita da Glucosio-6-fosfato Sensore di [glucosio] in sangue per la produzione di insulina 24

25 Metabolismo dell alcool Alcool deidrogenasi Aldeide deidrogenasi CH 3 -CH 2 OH CH 3 -CHO CH 3 -COO Etanolo Acetaldeide Acetato K M di alcool deidrogenasi per etanolo: 1 mm (46 mg/l) Enzima saturo dopo pochi drinks (anche uno) Metabolizzazione segue una cinetica di ordine zero Velocità: 10 g/h Diminuzione del tasso nel sangue: 0.15 g/l Indipendente dal tasso iniziale 3 varianti con poche differenze in termini di K M e V max K M di aldeide deidrogenasi per acetaldeide: 0.01 mm Livello di acetaldeide 1/1000 di quello di etanolo In presenza di isoforma con K M =1 mm, accumulo di acetaldeide Oriental flush [alcool] in sangue, g/l [aldeide], µm KM=1 mm KM=0.01 mm Tempo, ore dopo 0.6 g/kg Tempo, ore dopo 0.6 g/kg REGOLAZIONE DELL ATTIVITÀ ENZIMATICA Necessità fisiologica; Catene enzìmatiche; Controllo del livello di enzima; Ubiquitina; Fattori fisici e chimici di modulazione dell attività; Inibizione competitiva e non competitiva; Compartimentalizzazione intracellulare; Modificazioni allosteriche e covalenti; Allosterismo e cooperatività; Cinetica degli enzimi allosterici e cooperativi. 25

26 Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività enzimatiche siano regolate In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono anche venire completamente disattivati: Non produrre prodotti inutili Economizzare energia Aumentare rapidamente l attività se necessario Reversibilità delle reazioni enzimatiche L enzima favorisce il raggiungimento dell equilibrio, quindi in teoria potrebbe catalizzare anche la reazione inversa A B Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile A B C Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche) A B C D E Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili, in pratica il flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A B L accumulo di E chiude il rubinetto La mancanza di E riapre il rubinetto A B C D E 26

27 Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie ΔG<<0 (maggior efficacia) Precoci nella catena enzimatica Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici Capacità catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza catalitica) Controllo della concentrazione di enzima (regolazione lenta) Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari (ad eccezione dell eritrocita umano) sono sottoposte a ricambio ed equilibrio dinamico Quindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da: Velocità di sintesi della proteina Velocità di trasformazione da zimogeno in enzima attivo Velocità di degradazione 27

28 Velocità di sintesi Può aumentare in seguito all accumulo intracellulare del substrato (es: operon del lattosio) Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza relazione col substrato Può essere repressa dai prodotti terminali della catena enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto glucosio in E.coli) Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in enzima attivo proinsulina insulina 28

29 Chimotripsinogeno chimotripsina Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico 29

30 Velocità di degradazione Dipende da: Lisosomi, pinocitosi, endocitosi Ormoni (insulina, glucagone, glucocorticoidi ) Ubiquitina (The kiss of death), Nobel Prize 2004 Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose, Medical Sciences, Technion in Haifa and UC Irvine College of Medicine in California) Proteina altamente conservata (76 aa) e ubiquitaria Attivata da ATP Gli altri enzimi proteolitici non dipendono da ATP Si lega covalentemente alla proteina-bersaglio (Lys) Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la distruzione Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitinadipendente Regolazione del ciclo cellulare Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi durante mitosi e meiosi Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero anomalo di cromosomi (Down e tumori solidi) Riparazione del DNA, cancro e apoptosi Essenziale per mantenere il livello di p53 (il guardiano del genoma ) Risposte immunologiche e infiammatorie Regolazione di NF-kB (fattori di trascrizione) per attivare l espressione genica Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali) Fibrosi cistica Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane conductance regulator) 30

31 Compartimentalizzazione Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di molecole compartimentalizzandole in una zona delimitata da una membrana Esempio: GLUcose Transporter (GLUT) GLUT1, costitutivo GLUT4, inducibile da insulina ph Modulazione dell attività dell enzima (regolazione veloce) Temperatura Inibizione reversibile ed irreversibile: Competitiva Non-competitiva Uncompetitiva Modificazioni allosteriche Modificazioni covalenti 31

32 ph, temperatura e attività enzimatica Ogni enzima ha il suo ph ottimale Il ph ottimale può non corrispondere col ph in cui si trova l enzima Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale La temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in cui si trova l enzima (37 C) Velocità Aumento dovuto alla temperatura ( ogni 10 C) Risultato Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina Temperatura Inibizione competitiva e non-competitiva Competitiva: Substrato e inibitore si legano al sito attivo dell enzima Il complesso enzima+substrato è inattivo Non-competitiva: Quando l enzima lega l inibitore, l enzima cambia la conformazione e diventa inattivo 32

33 Inibizione competitiva I simile a S, compete con S per il sito attivo di E Inibizione reversibile all aumentare di [S] V max non cambia, K M aumenta v 0 1/v 0 V max inibitore inibitore V max /2 1/V max K M [S] 1/K M 1/[S] Esempi di inibizione enzimatica competitiva CH 3 OH Metanolo CH 3 -CH 2 OH Etanolo 33

34 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Metotrexato o antifolato, antileucemico che rallenta la biosintesi di purine e pirimidine Esempi di inibizione enzimatica competitiva Fluorouracile, analogo della mercaptopurina 34

35 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l enzima Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche Inibizione non competitiva I reagisce su un sito diverso dal sito attivo Tende a disattivare E Inibizione non reversibile all aumentare di [S] K M non cambia, V max diminuisce v 0 V max inibitore 1/v 0 inibitore V max /2 1/V max K M [S] 1/K M 1/[S] 35

36 Esempi di inibizione non-competitiva Degradazione proteica (temperatura, estremi di ph) Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei residui di Cys) Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della catena respiratoria Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi) Inibizione uncompetitiva I si lega al complesso ES 36

37 Inibizione uncompetitiva L inibitore reagisce con il complesso ES Cambiamenti simultanei di K M e V max V 0 1/V 0 V max + inibitore + inibitore 1/V max K M [S] 1/K M 1/[S] Modificazioni covalenti degli enzimi La fosforilazione AUMENTA l attività di alcuni enzimi Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi b chinasi, HMG-CoA reduttasi chinasi e altri... La fosforilazione DIMINUISCE l attività di altri enzimi Acetil-CoA carbossilasi, glicogeno sintasi, piruvato deidrogenasi, HMG-CoA reduttasi e altri... The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1992 Edmond H. Fischer and Edwin G. Krebs, Professors Emeritus, University of Washington, Seattle, USA for their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism 37

38 camp Ormone camp come secondo messaggero Recettore Proteina G Adenilato ciclasi ATP camp R R R C R C Protein chinasi A inattiva C C Protein chinasi A attiva 38

39 Allosterismo allo = l altro Attività enzimatica sotto il controllo di un modulatore Classe K o V: altera K M o V max Inibitore o stimolatore Interazione eterotropica: il modulatore è diverso dal substrato Interazione omotropica: il modulatore funge anche da substrato Jacques Monod Nobel Prize 1965 Quando due leganti si legano alla stessa proteina, possono influenzare l uno il legame dell altro Esochinasi (HK) Glucosio + ATP glucosio-6-fosfato + ADP Quando HK lega glucosio, l affinità per ATP aumenta Quando HK lega ATP, l affinità per glucosio aumenta 39

40 Allosterismo Effetto reciproco di due leganti quando i siti di legame sono separati Se i due leganti si legano alla STESSA conformazione di un enzima, ne risulta un interazione POSITIVA Se i due leganti si legano a conformazioni DIVERSE, ne risulta un interazione NEGATIVA Modello di enzima allosterico multimerico A provoca un cambiamento conformazionale che facilita il legame con S Il cambiamento conformazionale è trasmesso alla subunità adiacente Allosterismo e cooperatività: Allosterismo: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta ad un effettore allosterico Cooperatività: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta al cambiamento conformazionale della subunità adiacente Conformazione privilegiata nell evoluzione naturale: il destino di una molecola è associato alla presenza/assenza di un altra A S S A A 40

41 Cinetiche degli enzimi allosterici e cooperativi Sigmoide, non iperbolico NON-Michaelis-Menten Sempre più efficaci all aumentare del numero di subunità v 0 4 subunità 1 subunità 2 subunità [S] 41