Tutte le reazioni che avvengono nelle cellule sono reazioni catalizzate I catalizzatori di tali reazioni prendono il nome di enzimi Gli enzimi sono

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1 Tutte le reazioni che avvengono nelle cellule sono reazioni catalizzate I catalizzatori di tali reazioni prendono il nome di enzimi Gli enzimi sono grosse molecole proteine e ribozimi (RNA)

2 TEORIA DELLE COLLISIONI H la velocità di una reazione, misurata come quantità di prodotto ottenuto in un tempo definito, dipende dalla energia di attivazione l energia di attivazione è l energia necessaria per: allineare i gruppi reagenti formare cariche transitorie instabili riorganizzare legami operare tutte le trasformazioni necessarie per far avvenire una reazione gli enzimi modificano solo la velocità della reazione e non gli equilibri

3 L energia di attivazione può essere abbassata aggiungendo un catalizzatore In presenza di un catalizzatore, la reazione raggiunge l equilibrio molto più rapidamente perché la velocità della reazione è molto superiore alla norma. La reazione è scomposta in più tappe caratterizzate da valori di G* inferiori nelle quali si ha formazione e scomparsa di specie chimiche transitorie (ES, EP)

4 DIFFERENZE TRA ENZIMI E CATALIZZATORI INORGANICI Peso molecolare I catalizzatori chimici sono composti molto semplici spesso anche semplici atomi, mentre gli enzimi sono molecole proteiche e, quindi, espressione dei geni. Sono caratterizzati da un peso molecolare molto alto. Capacità di regolazione: controllo allosterico; modificazione covalente degli enzimi; variazione della quantità di enzima sintetizzato Specificità Capacità catalitica Diversamente dai catalizzatori inorganici che catalizzano numerose reazioni anche molto diverse tra loro, gli enzimi sono altamente specifici. La maggior parte di enzimi agisce su di un unico substrato o su un numero molto limitato di composti. Gli enzimi accelerano le reazioni da un milione fino a volte.

5 Caratteristiche enzimi 1. La maggior parte sono proteine che svolgono un attività catalitica nei sistemi biologici accelerando le reazioni ( volte) 2. Ogni cellula contiene alcune migliaia di enzimi diversi e sono localizzati in determinati punti della cellula a seconda della funzione da svolgere 3. Sono altamente specifici 4. Non influenzano l equilibrio di una reazione chimica 5. Sono efficaci in piccole quantità, e funzionano anche dopo essere stati estratti da essa 6. Ogni enzima ha una capacità catalitica espressa dal numero di turnover cioè dal numero di molecole di substrato che viene convertito in prodotto nell unità di tempo da una singola molecola enzimatica in condizioni ideali

6 Capacità catalitica:

7 SPECIFICITA DEGLI ENZIMI S intende la discriminazione che un enzima opera tra diversi substrati in competizione per il sito attivo Assoluta, l enzima catalizza solo una reazione; (glucochinasi: fosforila solo glucosio) Di gruppo, l enzima catalizza substrati con lo stesso gruppo funzionale (esochinasi: fosforila glucosio, mannosio e fruttosio) Di legame, la capacità di riconoscere un tipo particolare di legame (peptidica, acetalico, estereo) Stereospecificità, la capacità di ottenere un solo stereoisomero

8 Classificazione internazionale degli enzimi: a ciascun enzima viene assegnato un numero di classificazione composto di quattro numeri (EC: Enzyme Commission) oppure un nome sistematico che ne identifichi la reazione catalizzata 1 ossidoreduttasi: trasferimento di elettroni 2 transferasi: trasferimento di gruppi funzionali da una molecola ad un'altra 3 idrolasi: reazioni di idrolisi 4 liasi: reazioni di addizione o eliminazione di piccole molecole (CO 2 e H 2 O) 5 isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 ligasi: reazioni endoergoniche in cui 2 molecole sono unite tra loro

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10 Per esempio, l'enzima tripeptide amminopeptidasi ha EC i cui numeri indicano: Classe 3: il primo numero identifica la reazione catalizzata dall'enzima: enzimi della famiglia delle idrolasi; Sottoclasse 4: il secondo numero identifica il tipo di legame: idrolasi che agiscono su un legame peptidico Sotto-sottoclasse 11: il terzo numero identifica il tipo di substrato: idrolasi che agiscono su un legame peptidico di un tripeptide Numero seriale 4: indica numero di serie dell'enzima: la posizione dell enzima nella sotto sotto-classe

11 Struttura ENZIMI MONOMERICI: costituiti da una sola catena peptidica (subunità). Ne sono noti pochi (pepsina, tripsina, elastasi, carbossipeptidasi, trombina (E proteolitici), ribonucleasi, lisozima ENZIMI OLIGOMERICI: costituiti da 2 o più subunità, che possono essere uguali o diverse Proteine semplici Proteine coniugate possiedono un gruppo chimico legato alla proteina (gruppo prostetico in maniera covalente) per catalizzare una reazione, in quanto i residui AA non funzionano Proteina coniugata (oloenzima)= apoenzima+cofattore Apoenzima: parte proteica Cofattore: parte non proteica costituita da ioni metallici (Cu, K, Na, Zn, Mg) e altre molecole organiche derivate da vitamine idrosolubili dette coenzimi

12 SITO ATTIVO Gli enzimi sono delle proteine molte grosse pero solo una piccola zona (tasche, fessure, pieghe, solchi) è coinvolta: tale zona è chiamata sito attivo Il sito attivo ha due componenti: il sito catalitico, dove per mezzo dei gruppi R degli amminoacidi avviene la reazione e il sito di legame, dove il substrato si sistema per subire poi la reazione.

13 L enzima si combina chimicamente col substrato Il sito di legame tiene unito il substrato con legami deboli Riconoscimento complementarità per Il substrato viene riconosciuto quando è vicino e orientato correttamente

14 MODELLO D AZIONE Modello chiave-serratura: il substrato si lega al sito attivo come la chiave in una serratura. Modello dell adattamento indotto: la struttura dell enzima si adatta a quella del substrato.

15 I gruppi funzionali catalitici di un enzima interagiscono temporaneamente con un substrato mettendolo nella orientazione favorevole alla reazione: si forma il complesso ES. L interazione tra enzima e substrato è mediata da legami deboli non covalenti. La formazione di tali legami è accompagnata da rilascio di energia che costituisce la principale fonte di energia libera usata dall enzima per abbassare l energia di attivazione della reazione.

16 Funzioni dei cofattori Presenti in 2/3 degli enzimi coniugati 1) si legano al substrato in modo da orientarlo correttamentte per la reazione 2) partecipano a reazioni redox mediante il cambiamento reversibile del numero di ossidazione del metallo 3) stabiliizzano ellettrostaticamentte o protteggono le cariche negative

17 Coenzimi Sono molecole organiche, spesso derivate da vitamine Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione (uno dei casi più comuni) a trasformazioni più complesse. FUNZIONI: Agiscono da ossidanti e da riducenti Attivano i gruppi funzionali per ulteriori reazioni Forniscono un buon nucleofilo/base e permettano la delocalizzazione di elettroni I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi, in base al tipo di reazione catalizzata.

18 Coenzimi trasportatori di idrogeno Coenzimi piridinici (NAD + e NADP + ) Derivano dall acido nicotinico o niacina o vit. B 3 o PP) Sono coenzimi di deidrogenasi La forma ossidata viene indicata come NAD(P) + e quella ridotta NAD(P)H o, per meglio evidenziare il meccanismo della reazione, NAD(P)H + H + Il loro legame all apoenzima è labile, infatti dopo aver funzionato in un senso, si staccano e si legano ad un altra proteina funzionando in senso opposto. Si ha così la possibilità della riossidazione del coenzima

19 Nicotinamide Adenina Dinucleotide NAD + Fungono da accettori di idrogeno nell ossidazione di svariati composti (reazioni di ossido-riduzione). La loro riduzione avviene per trasferimento di uno ione idruro (H - ) dal substrato all anello piridinico del coenzima, con liberazione nel mezzo di un H +

20 FMN Coenzimi flavinici (FMN e FAD) Sono le forme coenzimatiche della riboflavina o vit. B 2. FMN e FAD sono strettamente legati ai propri apoenzimi con un legame covalente Sono coenzimi di ossidoriduzione Flavin adenin dinucleotide (FAD) Ribitolo La molecola, è costituita da 3 anelli condensati, che costituiscono la flavina, il quale è legato al ribosio tramite l'atomo di azoto dell'anello centrale.

21 I coenzimi flavinici, a differenza di quelli piridinici, accettano 2H + e 2e - pertanto le loro forma ridotte sono FMNH 2 e FADH 2

22 Coenzima Q (CoQ o UBICHINONE): è un composto di natura lipidica. Trasporta atomi di H e elettroni

23 I trasportatori di elettroni I trasportatori partecipano alle ossidoriduzioni trasferendo 2 elettroni alla volta

24 Coenzima A (CoA) Coenzimi trasportatori di gruppi Deriva dalla vitamina B5 Catalizza tutte le reazioni di trasporto di acili. Tale trasporto si realizza per la formazione di tioesteri

25 I citocromi sono proteine che contengono il gruppo prostetico eme (coenzima) contenente ferro Sono di 3 classi: a, b, c. Trasferiscono elettroni, mediante oscillazioni del Fe dell eme tra la forma ferrica Fe 3+ (ossidata) e quella ferrosa Fe 2+ (ridotta)

26 Il citocromo c 1

27 Reversibilità delle reazioni enzimatiche L enzima favorisce il raggiungimento dell equilibrio, quindi in teoria potrebbe catalizzare anche la reazione inversa A B Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile A B C Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche) A B C D E Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili (specie quelle con G 0), in pratica il flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A B L accumulo di E chiude il rubinetto La mancanza di E riapre il rubinetto A B C D E

28 Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività enzimatiche siano regolate 1) Modulazione dell attività dell enzima (regolazione veloce) secondi o minuti Un certo numero di fattori esterni agisce sull attività degli enzimi accelerando la conversione del substrato in prodotto: Concentrazione del substrato Temperatura ph Inibitori Modulatori positivi e negativi 2) Controllo genico della concentrazione di enzima (regolazione lenta) ore o giorni

29 Equazione di Michaelis-Menten (1913) Leonor Michaelis & Maud Menten Leonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 New York, October 8, 1949). Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 July 26, 1960), among the first women in Canada to earn a medical doctorate. At that time women were not allowed to do research in Canada, therefore she decided to do research in other countries such as the United States and Germany.

30 1 solo substrato Assunzioni di Michaelis-Menten K 1 K E + S ES 3 E + P K 2 L enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile e relativamente lenta Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che induce la formazione di P L enzima rilascia P e torna nello stato iniziale La velocità globale è regolata dalla formazione di ES

31 Curva iperbolica CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO Si osserva che, nel primo tratto della curva (rettilineo) la V è direttamente proporzionale alla concentrazione di substrato aumentando la concentrazione di S aumenta proporzionalmente il numero di molecole che formano il complesso ES Una volta raggiunta una certa concentrazione di S la v 0 cresce più lentamente fino a raggiungere un valore massimo quando tutto l enzima è saturato dal substrato e pur continuando ad aumentare la concentrazione di S la v 0 rimane costante (Vmax).

32 Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche Velocità A B V = k [A] Cinetica chimica Cinetica enzimatica [A]

33 In una reazione enzimatica E + S ES E + P v = V max v V max [S] v = K M V max 2 V 0 = V K max m + [ S] [ S] K M [S]

34 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche Grafico di Lineweaver-Burk V 0 1/V 0 V max V max /2 1/V max K M [S] -1/K M 1/[S]

35 effetto della temperatura sulle reazioni catalizzate da enzimi un eccessivo aumento della temperatura provoca la denaturazione degli enzimi con una modificazione irreversibile del sito attivo e una drastica riduzione dell attività catalitica Aumento dovuto alla temperatura ( ogni 10 C) Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina CURVA DI ATTIVAZIONE Velocità CURVA DI DENATURAZIONE Temperatura

36 effetto del ph sulle reazioni catalizzate da enzimi il cambiamento del ph altera il grado di ionizzazione dei diversi gruppi ionizzabili presenti in una molecola enzimatica; si può individuare un ph ottimale e un range di valori di ph entro cui l enzima mostra la massima efficienza

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38 INIBITORE: Sostanza che può bloccare o rallentare l attività enzimatica REVERSIBILE agisce con una modalità che consente all enzima di recuperare la propria funzionalità biologica 1. competitiva 2. Incompetitiva o acompetitiva 3. non competitiva/mista IRREVERSIBILE si lega con un legame covalente ad un residuo di un amminoacido presente nel sito attivo senza la possibilità di staccarsi quindi l attività dell enzima si annulla Non possono essere rimossi con mezzi semplici e sono utilizzati: - nello studio dei siti catalitici - come farmaci - come antiparassitari

39 INIBIZIONE IRREVERSIBILE Gli inibitori irreversibili legandosi covalentemente con un residuo amminoacidico nel sito attivo inattivano l enzima Generalmente possono essere veleni, tossine oppure farmaci Inibitore Formula Origine Meccanismo Diisopropil fluorofosfato (DFP) H 3 C CH 3 F CH 3 O P O O CH 3 Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo CH 3 F Sarin H 3 C Sintetico Come il DFP O P O CH 3 Penicillina R O HN O N S CH 3 CH 3 CH 3 Penicillum Notatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica

40 INIBIZIONE REVERSIBILE Formano con l enzima complessi reversibili: le interazioni leganti sono legami deboli oppure legami forti, ma facilmente reversibili: Legami idrogeno Interazioni dipolo-dipolo Interazioni idrofobiche Legami covalenti facilmente reversibili Legami ionici che possono essere facilmente reversibili per solvatazione degli ioni in acqua

41 Competitiva Non competitiva/mista Incompetitiva o acompetitiva Un inibitore non competitivo è una sostanza che si lega sia all enzima libero sia al complesso ES: la presenza dell inibitore riduce la velocità di formazione del prodotto modificando il sito attivo L entrata del substrato modifica il sito attivo, formando un nuovo sito per l inibitore che può entrare: agisce legandosi e formando il complesso ESI inattivo

42 Esempi di inibizione enzimatica competitiva Alcool deidrogenasi Aldeide deidrogenasi CH 3 -CH 2 OH CH 3 -CHO CH 3 -COO Etanolo Acetaldeide Acetato Coma etilico

43 ENZIMI ALLOSTERICI Un enzima allosterico è una proteina oligomerica (struttura quaternaria) oltre al sito attivo esistono anche siti diversi (allosterici) tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis Menten può esistere in una conformazione ad alta affinità per il substrato R ed in una conformazione a più bassa affinità per il substrato T Effettori sono molecole che interagiscono con i siti allosterici regolando l attività dell enzima modificandone la conformazione 1) Cooperatività: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta al cambiamento conformazionale della subunità adiacente 2) Allosterismo: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta ad un effettore allosterico positivo e negativo

44 MODELLO CONCERTATO MONOD Cooperatività: le subunità enzimatiche esistono in due stati conformazionali definiti T ed R (Teso e Rilassato), in equilibrio tra di loro. Il legame di un substrato modifica l'equilibrio spostandolo verso la forma R più affine.

45 ALLOSTERISMO S intende un cambiamento conformazionale dell enzima e quindi del sito attivo, a seguito dell interazione di un effettore positivo o negativo in un sito allosterico (regolatore)

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47 Cinetica degli enzimi allosterici e cooperativi Sigmoide, non iperbolico NON-Michaelis-Menten Sempre più efficaci all aumentare del numero di subunità v 0 4 subunità 1 subunità 2 subunità Bassa [SUB] la V cresce lentamente Intermedia [SUB] la V cresce rapidamente Alta [SUB] la V = Vmax [S]

48 INIBIZIONE RETROATTIVA (FEEDBACK) A volte la regolazione allosterica può fungere da controllo retroattivo quando il modulatore allosterico negativo (inibitore) è rappresentato dal prodotto della reazione enzimatica

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