Generalità sull importanza dell immunobiologia

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1 Seconda Università di Napoli III Anno I Semestre A.A. 2011/2012 Sbobinatura Immuno Prof Medici A cura di dodo Immuno Medici 1.1 (lunedì 3 ottobre 2011) Generalità sull importanza dell immunobiologia Partendo dai componenti degli Organi Linfoidi Primari, che rappresentano le culle le stazioni dove fanno sviluppare i linfociti delle cellule che non hanno ancora incontrato il loro Antigene (sostanza che è in grado di stimolare la produzione di specifici anticorpi) fino agli Organi Linfoidi Secondari che servono al vero e proprio sviluppo della risposta immunitaria; Andremo poi a studiare le singole cellule sia dell immunità Adattativa che Innata, le sostanze che interagiranno con esse cioè gli Antigeni; Studieremo gli Immunogeni, sostanze che Stimolano il sistema immunitario presenti nella porzione dell antigene che viene individuato dal sistema immunitario; I componenti che entrano in funzione nel sistema immunitario, quali le immunoglobuline ed altre molecole che entrano in contatto con l antigene, sia per la presentazione MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) sia l attivazione di una particolare classe quali i linfociti T, in oltre ci sono delle sostanze che regolano ed orientano la risposa cioè le Citochine e i loro recettori; Altra molecola importante del sistema immunitario è il Complemento che attiva i linfociti; Immunità dei trapianti, tumori, fino alle immunodeficienze cioè carenze sin dalla nascita. 1

2 Il termine immunologia deriva dal vocabolo Immunitas (immunità) cioè resistenza contro determinate sostanze estranee. Primo ricercatore fu Edward Jenner che formulò il primo vaccino (1769) contro il Virus del Vaiolo bovino, dove notò che alcuni lavoratori (mungitori) erano immuni contro il virus del vaiolo Umano perché erano stati in contatto con bovini malti di vaiolo. Da questa osservazione Jenner pensò che era possibile immunizzarli contro il vaiolo utilizzando il virus del vaiolo bovino che nell uomo non dava luogo alla malattia ma lo immunizzava contro di esso, formulando il primo vaccino! Altri successi della prevenzione: Difterite (Batterio), il cui agente biologico è Corynebacterium che agisce con una tossina; Poliomielite (enterovirus), grave malattia infettiva a carico del sistema nervoso centrale che colpisce soprattutto i neuroni motori del midollo spinale, il cui contagio avviene attraverso l'ingestione di acqua, cibi contaminati o tramite la saliva e le goccioline emesse con i colpi di tosse o starnuti da soggetti ammalati o portatori sani; Morbillo che può portare ad encefalite. Non tutte le sostanze posso stimolare il sistema immunitario quindi si è costretti a volte somministrare sostanze che Stimolano il sistema immunitario detti Aduivanti. Il sistema immunitario nel corso dei secoli si è Specializzato a costruire difese di tipo anticorpale contro numerosi agenti patogeni. Nell immunità possiamo distinguere due classi di immunità: Innata ed Adattativa o Acquisita. Immunità Innata (risposta rapida) risiede in cellule dove hanno ricevuto, nel loro corredo genetico (ereditato), una serie di informazioni per produrre determinate proteine per interagire contro determinate infezioni. I componenti principali dell immunità innata sono: Gli Epiteli, Neutrofili e Macrofagi (azione fagocitarla) e Natural Killer (NK) che hanno attività citotossica, il Sistema del Complemento, le Citochine e Chemochine. Immunità Adattativa o Acquisita non è presente dalla nascita, come quella innata, ma si sviluppa in risposta alle infezioni, dove gli attori principali, sono i Linfociti T e B, i quali riconoscono milioni di Antigeni grazie ai recettori che essi stessi producono, quindi Non Rientrano Nel Patrimonio 2

3 Ereditario ma il sistema immunitario li deve costruire negli organi Linfoidi Primari Il sistema immunitario deve poter rispondere dai Virus, Batteri, Funghi fino ai Parassiti, inoltre bisogna tener presente anche le dimensioni degli agenti patogeni, che si può andare dai manometri fino a metri. Il sistema immunitario deve essere capace di differenziare non solo il differenziamento ma anche il meccanismo con cui agire; rispondere rapidamente, di espandere e diversificare la risposta immunitaria. Una fusione che limita il sistema immunitario, soprattutto a carico dei quello adattativo è la velocità di risposta che si presenta lenta, ma molto facilitato dal sistema innato che rappresenta la prima difesa sia temporale che del riconoscimento. Per velocizzare la risposta ci serviamo della Vaccinazione. La risposta Primaria è lenta non è specifica nella funzione, ma la vera e propria risposta è quella Secondaria che è capace di combattere l agente estraneo avvantaggiata perchè trova un certo numero di cellule che hanno risposto e che memorizzano, dette cellule della Memoria, le quali non hanno solo la Funzione di Memorizzare ma anche Rispondere a quel determinato antigene. Ma un estrema specializzazione può creare qualche problema, nel corso dell espansione il sistema immunitario può commettere degli errori. Per evitare di commettere errori il sistema si avvale di Segnali ad esempio la reazione infiammatoria, detti anche secondi segnali. Se non ci sono i secondi segnali si va incontro che il sistema immunitario le riconosce come segnali propri. Altro errore è che il sistema immunitario si può rivolgere contro il proprio organismo dette malattie Autoimmuni. Il concetto di Patogenicità risiede nel fatto che un determinato microrganismo può creare danno. L enorme espansione di riconoscimento è dato dal variare del DNA presente nei linfociti T e B cioè ogni linfocita maturo presenta un DNA ben specifico cioè è avvenuto una ricombinazione per quei geni, materno e paterno, i quali si sono specializzati o diversificati nel riconoscere un singolo antigene. Questa diversificazione deve essere in un certo modo Limitata, in quanto nei linfoidi primari non è possibile la formazione di linfociti 3

4 che riconoscono il Self cioè di distinguere il Self dal Non-Sef (concetto di Proprio e Non Proprio cioè riconosco o non riconosco quella sostanza estranea) che avviene negli organi linfoidi primari. Le cellule poi devono essere Selezionate per la Loro Specificità perché non tutte le cellule che escono dagli organi linfoidi primari verranno attivate ma verranno attivate e rese sempre più specifiche pochissimi cloni rispetto a quelli che si generano negli organi linfoidi primari. Altra funzione è quella di Amplificare una particolare risposta cioè all interno degli organi linfoidi primari esistono più di una specie ma quella che deve essere selettivamente amplificata è la specie più adatta a quella particolare risposta. Poi abbiamo la differenza tra una cellula che è infettata da virus e un'altra cosa è rispondere contro un batterio che sta per infettare un'altra cellula o tessuto. In alcuni casi abbiamo antigeni intracellulari o extracellulari. Questa diversificazione può avvenire in momenti successivi ad esempio nella risposta primaria si ha un tipo di risposta ma al secondo incontro la risposta va a diversificarsi per essere molto più aggressiva verso un particolare agente biologico, quindi si ha una diversa modalità di risposta. Il tutto poi deve Spegnersi, nel momento in cui si allontana la sostanza estranea il sistema immunitario deve smettere si funzionare per cui ci sono meccanismi che controllano la risposta immunitaria. Ma spegnere non significa Dimenticare ma Ricordare cioè il sistema immunitario deve essere pronto per i successivi incontri dove risponderà in modo immediato, attento, quindi si avrà una risposta immunitaria Secondaria cioè avrà memoria di questo secondo incontro e non più come una risposta primaria. La Ridondanza cioè più tipi cellulari sono capaci di effettuare quasi la stessa cosa il che significa se un tipo cellulare fallisce ci sono altre cellula che svolgono la stessa azione cioè avere finzioni duplicate. Il sistema immunitario deve essere capace di Reinventarsi nelle proprie funzioni, spesso troviamo degli agenti biologici che variano la loro conformazione, ad esempio come un parassita che provoca la malaria Plasmodio che può variare i propri antigeni, oppure nel campo dei virus L Influenza che da un anno all altro varia i propri antigeni quindi si può intervenire con la Vaccinazione di anno in anno, ma nel caso della malaria, oggi, è difficile trovare un vaccino. 4

5 Quindi per avere una risposta Ottimale bisogna avere due Fasi: una Prima Fase di risposta immediata non specifica per un singolo antigene ma verso una classe di antigeni che caratterizzano un determinato patogeno quindi risposta INNATA quindi rapida perchè presentano una serie di recettori che ereditiamo dai nostri genitori, non sempre sufficiente ed ecco che entra la Seconda Fase quella ADATTATIVA che può agire con circa trenta differenti tipi di risposte immunitarie, è estremamente precisa e più mantenere memoria di un determinato incontro utile per secondi e terzi incontri ma lo sviluppo della memoria lo si può fare anche con la Vaccinazione. Tempi di risposta Innata da 0 alle 12 ore successive Adattativa 12 ore fino a diversi giorni Risposta primaria Cellule Vergini o naive Risposta secondaria o cellule della memoria 5

6 Immuno Medici 1.2 (Mercoledì 5 ottobre 2011) Principali differenze tra Immunità Innata ed Adattativa Come gia accennato i componenti dell immunità Innata sono le barriere fisiche come la cute e tutti gli atri sui componenti come peli, unghie che possono rappresentare una valida barriera contro l intrusione di sostanze estranee soprattutto di batteri. Oltre alla barriera esterna degli epiteli dobbiamo considerare anche le barriere epiteliali interne quali le Mucose come quella gastrointestinale che quella bronchiale e le loro secrezione tipo il muco che aiuta l allontanamento delle sostanze estranee, oppure l attività di enzimi come il Lisozima (prodotto dai granulociti neutrofili, basofili eosinofili, macrofagi, il loro substrato peptideglicano parete cellulare batteri Gram+ una volta attaccati assumono forma sferica), contenuto nella saliva e nelle lacrime la cui azione è quella di rendere la parete batterica più sensibile ai successivi attacchi compreso lo shack osmotico. Quindi nelle barriere va considerato l efetto fisico delle barriere (cute) sia le sostanze antimicrobiche al suo interno come le Defenzine; particolari classi di linfociti poco specializzati che riescono a funzionare come elementi dell immunità innata, infatti questi linfociti si ritrovano gia pronti all interno delle barriere epiteliali in numero sufficienti per riconoscere un ampia gamma di sostanze estranee, vengono considerati linfociti che si trovano a metà strada tra l immunità innata ed adattativa come il Natural killer che può intervenire con o senza anticorpi. Oltre ad enzimi ci sono delle cellule come i linfociti, fagociti, una particolare classe di linfociti quali i Natural killer (NK), poi ci sono componenti solubili in circolo come il Complemento, le proteine della fase acuta che aiutano l azione successiva dei fagociti. Lo scopo dell immunità innata è la rapidità, purtroppo non è specifica di ogni specifico antigene ma specifica di gruppi di sostanze estranee. Meccanismi effettori sono sia mediati da cellule ad esempio Fagociti, sia di tipo Umorale ad esempio il complemento o il lisozima, proteine della fase acuta. 6

7 Scopo tu tutti questi meccanismi è di mantenere frenata l azione del patogeno nelle ore iniziali e in qualche caso anche giorni per dare tempo alle difese più sofisticate di potersi organizzare e poi agire. L immunità innata, a parte essere rapida, è dare la reazione infiammatoria, importantissima per il richiamo successivo sia delle stesse cellule dell immunità innata che di quelle di tipo adattativa. Purtroppo ci sono cose che non possono funzionare bene nel corso dell immunità innata, infatti l immunità innata funziona tal quale all inizio o alla fine dell evento infettivo quindi non esiste nessun adattamento a stimoli differenti, come pure non c è protezione verso varianti di patogeni che si possano formare nel corso dell infezione che non sono riconosciuti dell immunità innata. Da parte dell immunità innata non c è possibilità di memorizzare un infezione pregressa e quindi di Adattarsi a quella particolare infezione, quindi Assenza di Memoria. L immunità innata è di tipo Costitutivo, cioè che i recettori dell immunità innata li ereditiamo in modo identici sulle singole cellule. Segnali di danno, di tipo aspecifico quale LPS o LipoPoliSaccarici, possono attivare le funzioni dell immunità innata e quindi scatenare la risposta infiammatoria. Per quanto riguarda i componenti dobbiamo dividere in componenti cellulare come i fagociti quali i macrofagi e neutrofili o cellule Natural Killer (NK) una particolare classe di linfociti che non possiede recettori specifici. Per quanto riguarda componenti Umorali quale il complemento, nella sua parte che si attiva mediante meccanismi dell immunità innata e proteine della fase acuta. Immunità Adattativa è altamente specifica, è antigene specifica non riconosce una classe di antigeni ma riconosce un Singolo antigene, avvolte basta un singolo amminoacido o un singolo gruppo chimico perché l immunità innata non riconosce più quel determinato antigene. Ha la capacità di ricordare infatti il primo incontro con l antigene, ha la capacità di amplificare determinate cellule che restano nel nostro organismo per un determinato periodo, questo periodo si chiama Memoria Immunologia che è più o meno lungo a seconda della caratteristica della risposta che è capace di dare quel singolo antigene. 7

8 Questa memoria da la possibilità di rispondere successivamente in maniera più veloce, più forte e in maniera più specifica come tipo di risposta. Si adatta molto bene ad un eventuale evoluzione del patogeno, quindi variazioni degli antigeni o l estrema variabilità di grandi numeri di antigeni che riconosce, consente al sistema di essere molto adattabile ai vari stimoli patogeni che può incontrare. Tuttavia i patogeni usano alcuni trucchi che possono adottare per sfuggire al sistema immunitario: Possono presentare degli antigeni nascosti come nei parassiti che utilizzano dei veri e propri scudi davanti agli antigeni o addirittura cambiarli nel tempo o provocare un abbattimento delle difese immunitarie mediante la produzione di molecole immunosoppressive come ad esempio alcune citochine, importantissime per la regolazione della risposta immunitaria e virus che abbattono la produzione di determinate citochine importantissime per la risposta contro questi virus. Quindi specificità = memoria e adattabilità. Per quanto riguarda la caratteristiche dell immunità adattativa i recettori sono codificati da segmenti multipli di geni che da la potenzialità al nostro genoma di codificare per molte più proteine però i pezzi di geni devono essere adeguatamente riarrangiati quindi senza un corretto riarrangiamento non potranno produrre un buon recettore come i linfociti B e T i quali recettori sono Tcr (T cell receptor responsabile del riconoscimento degli antigeni presentati da MHC, recettore presente su tutti i T maturi) e Bcr (non ha bisogno di presentazione da parte di MHC, inoltre può essere staccato dalla cellula B e viaggiare nei fluidi) quali recettori sono prodotti sono dopo riarrangiamento dei geni dei segmenti multipli. Altro concetto è la Distribuzione Clonale di questi recettori, cioè come abbiamo detto nell immunità innata i recettori sono tutti presenti contemporaneamente su ogni cellule ad esempio macrofago, mentre sul linfocita il recettore necessario per il riconoscimento specifico è presente in un solo tipo quindi tutti i cloni prodotti avranno quella singola specificità quindi Distribuzione Clonale singoli cloni hanno singole specificità. Inoltre i linfociti hanno la capacità di distinguere singole molecole la sostituzione di un singolo amminoacido perché una proteina non può non essere più riconosciuta dall immunità adattativa o recettori che riescono ad individuare strutture destro o levogire. 8

9 L immunità specifica si divide in due grossi gruppi: di tipo Umorale e di tipo Cellulo-mediata. L unità Umorale è mediata dai linfociti B mentre la Cellulo-mediata dai linfociti T, ma va considerato che i linfociti T in molti casi aiutano i B. Il suo target ad esempio, sui batteri extracellulare, virus, mediante l unita umorale, queste sostanze che circolano sono capaci di Bloccare cioè rendere una tossina inattiva mediante una molecola secreta dall immunità adattativa ad esempio un virus può non più entrare all interno della cellule se c è un anticorpo che va a bloccare le proteine indispensabili per l attecchimento sulla cellula, o rendere fagocitabili questi microbi esterni. L unità Cellulo-mediata è la risposta a microbi Intracellulari, ad esempio microbi intracellulari nei macrofagi non potranno mai essere attaccati da sostanze solubili ma avranno bisogno di linfociti di tipo T che devono andare ad interagire con la cellula per poter innescare quei meccanismi di distruzione all interno della cellula, è il caso del linfocita T che va a stimolare un macrofago ad attivarsi per distruggere i microbi che si trovano all interno; altre volte il linfocita T interagisce con una cellula infettata da un virus e per impedire la replicazione e diffusione di questi virus fa morire la cellula in modo apoptotico, il linfocita preferisce sacrificare la cellula per impedire l invasione in altre cellule che si trovano accanto alla cellula infettata, quindi tipica azione Cellulo-mediata. Esistono due tipi di immunizzazioni, Attivo o Passivo le quali presentano vantaggi e svantaggi. Nel caso dell immunità Passiva, se vogliamo eliminare subito l effetto di una tossina (tetano, bacillo Clostridium clava tetani, gram positivo sporigeno) andremo a somministrare non il vaccino, ma daremo direttamente delle sostanze (siero) che andranno a bloccare direttamente la tossina cioè anticorpi che sono stati selezionati contro quella tossina, quindi ha un azione immediata ma il suo svantaggio è che non conserva memoria, perché non abbiamo fatto espandere quei coloni e resa la conoscenza di questo passaggio. Nel caso dell immunità Attiva andremo a stimolare l organismo direttamente con frazioni dell agente microbico e la cosa importante si manterrà memoria di questo contatto, la cosa negativa è che ci vorrà del tempo. 9

10 Dove Nascono, Vivono ed Agiscono le cellule del sistema immunitario? Le cellule del sistema immunitario di tipo Adattativo nascono negli organi Linfoidi Primari (timo T, midollo osseo B), infatti qui si riorganizzano i geni per poter riprodurre poi i vari recettori ed avere una selezione idonea per funzionare quindi avere un idoneità, verificare un corretto riarrangiamento dei geni e quindi il funzionamento del TCR e BCR e verificare che non si producono TCR e BCR contro antigeni Self. Quindi dagli organo linfoidi primari escono i cosiddetti linfociti Vergini cioè mai stati attivati. Il primo incontro con l antigene avviene negli organi Linfoidi Secondari (tonsille, adenoidi, linfonodi, la polpa bianca della milza, organi linfoidi associati alla cute e alle mucose MALT). I linfociti naive raggiungono gli organi linfoidi primari, poi ricircolano nel sangue, se attivati raggiungono la sede infiammatoria, se invece non hanno incontrato nessun antigene continuano a ricircolare negli organi linfoidi secondari. Le molecole che governano questo tipo di circolazione infatti in questa particolare circolazione, negli organi linfoidi secondari sono localizzate le cellule capaci di presentare l antigene infatti è negli organi linfoidi secondari che viene Concentrato l antigene estranio, per cui altra funzione degli organi linfoidi secondari è Raccogliere tutte le cellule, segnali dannosi che provengono dai tessuti infiammati o da dov è avvenuta l introduzione del patogeno. Vari tipi di recettori presenti, sulle cellule dell immunità innata, sono ad esempio Toll-like receptor (TLR) che si trovano sulla superficie delle plasma membrane degli endosomidelle celle dendridiche, dei fagociti, delle cellule endoteliali. I recettori TLR riconoscono una serie di molecole virali e batteriche. Un'altra classe di recettori sono quelle delle Lectine che sono capaci di riconoscere il Mannosio quindi sono capaci di distinguere la superficie di un batterio da una superficie di una nostra cellula. Altra classe sono i recettori Spazzini (presenti sui macrofagi), oppure LNR capaci di riconoscere i peptidoglicani e recettori che riconoscono N-formil-metionina cioè il primo amminoacido delle proteine dei batteri che mediante questo semplice riconoscimento è 10

11 possibile, per il sistema immunitario innato, riconoscere una proteina batteria da una nostra proteina. Per quanto riguarda le molecole solubili come Pentraxine, Collectine capaci di aiutare il successivo riconoscimento delle sostanze riconosciute dal sistema immunitario innato. Un altra funzione del sistema immunitario innato è di riconoscere il materiale genomico estranio o eliminare materiale estraneo che non è d aiuto per le nostre cellule. Il sistema immunitario innato, inoltre, riesce a riconoscere un DNA batterico da un DNA un eucariota, infatti il DNA batterico possiede delle sequenze ricche di CG poco metilate quindi riesce a stabilire una differenza ed attivare i meccanismi dell immunità innata. Alcuni Profili Molecolari Associati ai Patogeni (PAMP) riconosciuti dall immunità innata come ad esempio riconoscere RNA Virale, dove la caratteristica di questo RNA è quella di passare spesso in una fase a doppia elica. Infatti il sistema immunitario innato lo riconosce e lo elimina ed è quindi un sistema che utilizza per limitare la replicazione dei virus che nel corso della loro vita producono questo tipo di RNA. Quando i vari recettori si attivano, le cellule, come prima cosa, aderiranno meglio all endotelio quindi si avrà la prima fase dell emigrazione ai tessuti, attivano alcune chinasi portando alla produzione di Interferone che cerca di limitare quelle funzioni della cellula infettata utili alla replicazione dei virus, favorendo in ultimo la fagocitosi in quanto riconoscono la superficie del patogeno facendo attivare i meccanismi di internalizzazione del batterio nei fagociti. Altri profili molecolari sono: LPS (lipopolisaccaride caratteristico della parete dei Gram negativi) attiva la funzione dei macrofagi; Mannosio dei batteri; Fosforilcolina presente in alcune membrane di batteri riconosciute mediante una proteina di della Fase Acuta detta Proteina C reattiva plasmatica PCR (prodotta normalmente in basse quantità, ma in fase d infezione vengono prodotte delle citochine che vanno a stimolare il fegato) la sua funzione è quella di attivare il Complemento attraverso la Via Classica. Concetto che oggi si rafforza è che l immunità innata Collabora con quella adattativa, infatti l immunità adattativa riesce ad eliminare anche falsi segnali. Il linfocita si attiva non semplicemente con l incontro con l antigene ma c è bisogno che il linfocita deve essere molto Sicuro che quella è una sostanza che sta creando danno e questo lo stabilisce grazie alla collaborazione con l immunità innata 11

12 infatti l innata presenta quei recettori di segnale di danno, di sostanze estranee non self quindi questo secondo segnale serve per l attivazione del linfocita vergine ma nel momento in cui il linfocita vergine incontra una sostanza che può riconoscere ma la riconosce senza il secondo segnale, il linfocita vergine andrà incontro ad Anergia cioè continuerà ad ignorare per sempre quella sostanza. Citofluorimetro: quanto una sorgente laser va a colpire una cellula si produce una rifrazione (più è complessa una cellula più il raggio di luce è rifratto) o una diffrazione (studia la grandezza della cellule) cioè due parametri ce permettono di studiare la differenza tra un linfocita da un granulocita. Immuno Medici 1.3 (Giovedi 6 Ottobre 2011) Essenzialmente in una differenziazione di tipo funzionale ciascun linfocita lo ritroviamo in differenti organi linfoidi quindi ciascun linfocita avrà proverà differenti tipi di superfici che permettono loro di soffermarsi in particolari tessuti infatti le cellule hanno delle molecole capaci di indirizzare queste cellule in distretti particolari, la stesa cosa vale per queste tre classi di linfociti. La vita e poi l attivazione di un linfocita passiamo da una fase vergine giunti a maturazione poi i linfociti che controllano l antigene vanno incontro ad attivazione la quale permette che una parte di linfociti diventa effettrice un'altra parte si mette a riposo e diventa linfocita disattivato. Come abbiamo detto i linfociti vergini si vanno a localizzare nei tessuti linfoidi secondari, mentre i linfociti attivati o quelli effettori vanno nel tessuto sede di infiammazione mentre, quelli della memoria sono più distribuiti e vanno sia nel sito di infiammazione, quindi pronti ad attivarsi o in parte restano residenti nelle mucose. Qual è il numero di cellule per un particolare antigene? Un dato importante è sapere che per un singolo antigene il numero di cellule vergini sono estremamente poche infatti il nostro tessuto linfoide primario (timo o midollo osseo) produce un enorme variabilità di cellule vergini che ha una conseguenza che per ciascun particolare antigene sono presenti pochissime cellule, non hanno i numeri sufficienti per poter andarsi a localizzare nelle sedi 12

13 dell infiammazione e quindi poter agire, quindi bisogna amplificare il numero aumentare cellule vergini. Mentre per quanto riguarda cellule Attivate, gia pronte per svolgere la propria azione, per un particolare antigene possiamo avere un numero estremamente alto di cellule. Naturalmente la distribuzione di questi antigeni che possono essere riconosciuti dalle cellule effettrici è molto basso ma il vantaggio che per i pochi antigeni che sono presenti sono presenti molte cellule. Le cellule vergini normalmente sono quiescenti e per poter attivare il proprio ciclo cellulare hanno bisogni dell antigene, mentre le cellule attivate hanno pronto il loro sistema di duplicazione e clonazione ed ecco la ragione per cui queste cellule hanno attivo il ciclo cellulare quindi consente alle cellule di rimanere in numero elevato. Il ciclo cellulare può attivarsi il momento in cui incontrare l antigene ma nel momento in cui l antigene scompare ecco che il cicco cellulare resta quiescente. Più è quiescente il ciclo cellulare più ci sarà perdita naturale di cellule della memoria ed ecco che siamo costretti a fare un Richiamo dopo la prima vaccinazione. Per quanto riguarda le molecole in superficie un recettore importante (emopoietica/interferone o α-β-γ) per i linfociti è l Interleuchina 2 (citochina) molto importante per attivare il ciclo cellulare. Nelle cellule vergini che non sono sensibili, cioè non devono attivare il ciclo cellulare, il recettore dell interleuchina 2 è scarso, ma il discorso è diverso per le cellule attivate perché sono molto sensibili alla interleuchina 2 quindi si avrà un alto numero di recettori per l interleuchina 2. Un altro recettori Homing (consentono al linfocita di essere indirizzato verso un organo linfoide secondario oppure verso un organo specifico in cui vi è proliferazione di patogeni) L-selectina che è presente nei linfociti vergini ma presente in quantità molto basse nelle cellule della memoria attivati. La differente distribuzione delle L-selectine comporta che i linfociti vergini aderiranno agli endoteli che potranno legare la L-selectina, quali gli organi linfoidi secondari. Il vantaggio di questa selezione di tessuti è che gli organi linfoidi secondari è quel organo deputato alla concentrazione dell antigene quindi aumenta la probabilità di far incontrare l antigene con i linfociti vergini. Da una parte concentra dall altra richiama linfociti; Mentre i linfociti attivati e quelli della memoria devono lasciare gli organi linfoidi secondari perché hanno ricevuto il 13

14 loro messaggio e non presentano più le selectine ed escono dall organo linfoide secondario, ma presentano un integrina CD44 poco presente nei linfociti vergini mentre presente nei linfociti attivati e quelli della memoria, questo comporta che quando c è questo scambio di molecole i linfociti attivati e quelli della memoria potranno localizzarsi negli endoteli sede di infezioni. Tutto questo è favorito da altri recettori quali le Chemochine (prodotte durante l azione infiammatoria) le quali vengono prodotti dagli organi linfoidi secondari e dai tessuti infiammati che vanno ad attivare o i linfociti vergini o linfociti attivati. CD45 è una molecola di superficie che è capace di regolare la capacità di una risposta ad un antigene, è una molecola che non è particolarmente sensibile ai segnali quindi ha bisogno di un forte segnale per attivare il linfocita vergine, ma nel momento in cui si attiva la CD45 cambia conformazione e rende il linfocita più sensibile all attivazione. Per quanto riguarda i linfociti B le molecole di superficie sono differenti dove andranno a produrre un tipo di immunoglobulina universale come le IgM, mentre se attivato produrrà immunoglobulina più specifiche (IgG,IgA,IgE) o un aumentata capacità di interagire con l antigene o attività diverse. I linfociti vergini B non hanno nessuna funzione effettrice se non quella di aspettare l incontro con l antigene e quando si attivano sono pronti a secernere anticorpi. Le cellule vergini presentano un citoplasma piccolo mentre le cellule specializzate presentano un citoplasma più grande ed un apparato del Golgi più sviluppato. Il linnfociti B possono specializzarsi nella produzione di anticorpi fino a diventare Plasmacellule. Anche per i linfociti B c è un gioco di Chemochine e molecole di adesione fa sì che questi linfociti si localizzeranno prevalentemente negli organi linfoidi secondari o nel midollo osseo o tessuti sede di infiammazione. Le caratteristiche degli organi linfoidi primari (timo, midollo osseo) devono presentare dei microambienti capaci di far differenziare le cellule staminali pluripotenti mediante proteine (citochine) e fattori di crescita particolari che vano a stimolare la proliferazione e differenziamento di queste cellule. La struttura del timo si presenta come un organo bilobato, oculato, presenta una midollare (maturi dove incontreranno cellule APC le 14

15 quali espongono antigeni MHC self del timo e servono ad eliminare le cellule T auto reattivee a mantenere cellule T che riconoscono il Self) e una corticale (riarrangiano i geni per i loro TCR e decidere quale linea specializzarsi se CD4 o CD8), vasi di ingresso e l uscita dei linfociti dal timo, solo quando maturi rientrano nel torrente circolatorio. L ambiente timico è costituito presenta delle lamine di cellule epiteliali dove aderiscono i linfociti che si stanno sviluppando, si ha anche la prima educazione come ad esempio avere dei buoni recettori se no la cellula va eliminata mediante apoptosi (incidenza molto alta, sono pochi i linfociti che lasciano il timo) o che riconoscono il Self anche in questo caso va eliminata o deve avvenire la maturazione di quei linfociti capaci di riconoscere quelle molecole (MHC) che servono alla presentazione di antigeni. Le cellule timiche per esprimere tutti i possibili antigeni presentano un fattore di trascrizione particolare chiamato AIRE che è capace di agire su moti geni del nostro organismo. Il timo con il passare degli anni regredisce ed il tessuto timico viene sostituito da tessuto adiposo, quindi in un certo senso nell adulto si ha una sorta di invecchiamento del sistema immunitario. Nella Maturazione dei linfociti, ciascun linfocita è caratterizzato dalla presenza di determinate proteine sia intra che extracellulari di superficie quindi studiare queste molecole è possibile studiare il grado di maturazione di quella cellula linfocitaria. Oggi infatti, negli studi dei Tumori Linfoidi, è possibile risalire, con adeguati marcatori, da quale grado di maturazione è partita la cellula tumorale, questo serve perchè a seconda del grado di maturazione la cellula può avere delle caratteristiche biologiche differenti. Alcuni marcatori, evidenziati nella prime fasi di maturazione, sono ad esempio i TdT (terminal desossiribonucleotide transferasi) un marcatore tipico di una cellula che ancora non ha terminato il suo arrangiamento dei geni, una volta terminato il riarrangiamento in superficie compare un'altra molecola CD3 quindi si capisce che il Tcr (recettore deputato per la traduzione del segnale) è sintetizzato quindi presente sulla superficie, quindi in seguito possiamo avere 2 catene che identificano il Tcr che servono alla interazione γδ αβ e poi anche 2 molecole CD4 e CD8 che identificano le 2 classi di linfociti che interagiscono con molecole MHC di classe II, inizialmente presenti entrambi i CD ma poi il linfocita presenterà solo uno dei due CD. 15

16 Un altro recettore importante per la proliferazione è CD1 e CD2 proliferazione che avviene soprattutto nella fase iniziale per la presenza di maturazione che porta al riarrangiamento del gene. Analizzando meglio il processo possiamo dire che attraverso il vaso entra il linfocita immaturo che ancora non produce Tcr, le cellule timiche danno l opportuno stimolo alle cellule per la proliferazione e per innescare il riarrangiamento per i geni, i geni vengono riarrangiati e si produce il Tcr. Prima domanda che si fa il timo: questo Tcr riconosce il Self? se non lo riconosce queste cellule vanno in apoptosi, se lo riconosce il processo va aventi e si chiederà il timo, questa cellula riconosce l antigene self? Si e vanno ad apoptosi. Se non riconosce antigeni self il processo continua e il linfocita si specializza nella funzione CD4 CD8. nel momento in cui diventa CD4 o CD8 può lasciare la midollare quindi nel vaso. Il destino del linfociti B è di entrare negli organi linfoidi secondari che possono essere linfonodi oppure o il tessuto bianco della milza, se incontrano l antigene diventano cellule effettrici se no ricircolano ancora. Negli organi linfoidi secondari dobbiamo tener presente che esistono una serie di vasi che permettono l ingresso di cellule o dell antigene e l uscita, poi, delle cellule attivate o che sono rimaste vergini. Infatti individuiamo un vaso Afferente linfatico da dove entra la linfa che viene drenata del vicino distratto o viceversa questa individuazione è importante in termini di diagnosi per capire quale organo o tessuto è stato colpito da patologie. Il primo linfonodo, sede di infiammazione, recepisce cellule che sono deputate a presentare l antigene, le cosiddette APC, poi abbiamo un vaso arterioso da cui entrano linfociti SOLO vergini che si sono maturati nel Timo, solo vergini perché il vaso riconosce i linfociti maturi impedendo loro l ingrsso ma permettendo l ingrasso dei linfociti vergini. Possono entrare linfociti sia T che B. Dal vaso linfatico Efferente possono uscire sia linfociti che hanno subito l incontro con l antigene che si sono attivati sia linfociti vergini. Una volta usciti del vaso efferente vanno a finire in un'altra stazione linfonodale o alla fine nel dotto toracico, quindi rientrare in circolo. Nel rientrare in circolo dobbiamo distinguere: se sono rimaste cellule vergini, quindi percorreranno la strada per rientrare in un nuovo linfonodo del tessuto linfoide secondario oppure, nel caso in 16

17 cui si sono attivate, si soffermeranno nel tessuto periferico svolgendo la loro azione, una parte di queste cellule attivate saranno cellule della memoria o che rimarranno nei tessuti o si localizzeranno in particolari zone del tessuto linfoide secondario soprattutto nelle mucose. Le cellule che sono giunte a maturazione che hanno incontrato l antigene o che non lo hanno incontrato usciranno attraverso il vaso linfatico efferente e non attraverso l arteria perché dall arteria usciranno solo i linfociti vergini o non attivi (da effettuare un controllo perché sul registratore non si sentiva bene questa parte sottolineata) Un linfocita vergine per entrare selettivamente in un linfonodo linfoide secondario, deve essere riconosciuto da alcune molecole del endotelio del linfonodo il cui endotelio ha una caratteristica morfologica particolare chiamato HEV cioè cellule endoteliali di alto spessore. Con tecniche di immunofluorescenza si possono individuare sia i T (rossa) che B (verde). Dal punto di vista strutturale la polpa bianca è diversa dal linfonodo ma funzionalmente sono molto simili perché entrambe presentano delle zone per la proliferazione all attivazione sia dai T che dei B. Altro tessuto linfoide secondario è quello associato alle mucose (MALT) le quali hanno nel loro interno delle cellule già specializzate perché sono soggette ad un continuo incontro con degli antigeni esterni o potenziali patogeni come ad esempio l intestino, tessuto bronchiale. Anche in questi tessuti sono presenti delle zone specializzate per far proliferare le cellule B grazie all aiuto delle cellule T. Le cellule vergini, per attraversale l endotelio HEV, presentano dei recettori la L-selettina e il recettore per la chemochina CCR7 dove troveranno il ligando per la L-selettina e la chemochina CCR19 o 21 che attiverà l ingrasso della cellula attraverso l endotelio HEV. Per le cellule attivate avremo il ligando per la L-selettina EP che troviamo sugli endoteli sede di infiammazione che permette quindi l adesione iniziale lenta, ma quello che determina l arresto stabile della cellula attivata è invece LFA1 VL4 dove sul endotelio troverà IGAM1. Anche qui vi sono delle citochine e recettori specifici che sono indispensabili per questa funzione. 17

18 Immuno Medici 1.4 (Lunedì 10 Ottobre 2011) Molecole In grado di Legare L'Antigene Appunti di dodo Le molecole dell Immunità Adattativa sono quelle molecole che interagiscono con l antigene, molecole prodotte dai linfociti B o T o che aiutano l interazione del peptide cioè il Tcr o Bcr. La grossa differenza tra un Bcr e un Tcr è che il Bcr ha le immunoglobuline come recettore dove presentano una duplice funzione Effettrice e Recettoriale. Per quanto riguarda la funzione Recettoriale le immunoglobuline possono riconoscere sia macromolecole (proteine, lipidi, polisaccaridi) che piccoli composti chimici. Ben diversa è la funzione del Tcr che è capace di riconoscere porzioni dell antigene (peptidi) però complessati al complesso MHC. Le immunoglobuline possono riconoscere grosse porzioni dell antigene sia porzioni lineari che conformazionali dell antigene, mentre il Tcr riesce a riconoscere pochissimi residui aminoacidici. Un'altra grossa differenza è l affinità che influenzerà il tempo di contatto e le concentrazioni reciproche dell antigene infatti il Bcr ha un affinità molto più alta del Tcr ciò comporta un tempo di associazione piuttosto rapida rispetto al Tcr che ci metterà molto più tempo per il riconoscimento dell antigene. Il riconoscimento dell antigene deve essere estremamente specifico se non lo fosse potrebbe portare ad un problema al sistema immunitario. Essendo molto specifico, la diversificazione tra i recettori deve essere enorme, più aumenta la specificità più deve essere presente un numero di diversi recettori capaci di individuare un antigene specifico, cosa molto diversa che avviene nell immunità innata dove sono presenti pochi recettori con una specificità per una classe di antigeni, il tutto deve avvenire con un alta affinità con il concetto di Avidità cioè più siti leganti concorrono al riconoscimento della stesa porzione dell antigene, infatti con una mancata affinità viene incontro l avidità il numero di interazioni contemporanee che una di queste molecole più riconoscere contemporaneamente, altra cosa che deve avvenire bisogna attivare per ciascun antigene una funzione quanto più possibile specifica. Il termine Immunogeno indica una sostanza capace di stimolare il sistema immunitario 18

19 Antigene è una sostanza riconosciuta come estranea ma che poi deve essere resa immunogena, ma non tutti gli antigeni possono essere resi immunogeni. Altro concetto è che l antigene viene riconosciuta una piccola porzione che può essere che più essere chiamata Determinante antigenica ma avvolte il determinate antigenico per poter essere immunogeno deve essere coniugato ad un carrier, quindi una porzione che deve essere riconosciuta deve stimolare il sistema immunitario viene chiamata Aptene che coniugata al carrier la fa diventare immunogena. Nell ambito dell antigene distinguiamo Epitopi o Determinanti antigenici, molto spesso gli antigeni sono estremamente grossi e gli anticorpi non riesco ad interagire con tutto l antigene ed ecco che usano dei siti specifici siti dell antigene chiamati Determinanti. Le molecole che riconoscono un antigene attraverso uno o due determinanti vengono chiamati Anticorpi, prodotti dal Linfociti B che hanno come recettore gli stessi anticorpi per cui è una molecola estremamente flessibile nel suo funzionamento deve essere prodotta sia sottoforma di proteina di membrana che deve fungere da recettore, sia la stessa molecola deve essere prodotta in forma solubile ed andare ad agire poi a distanza. Come detto precedentemente, non tutti gli antigeni sono immunogeni ma ci sono fattori che contribuiscono all immunogenicità di un antigene, fattori come l Estraneità cioè più una molecola è estranea maggiori probabilità ci sono che questa molecola viene riconosciuta ed attivare il sistema immunitario. Per quanto riguarda la Composizione Chimica, la risposta immunitaria sarà ben diversa nei confronti di uno zucchero che nei confronti di una proteina, infatti le modalità di presentazioni cambiano da molecole a molecole, inoltre influenza anche sulla struttura primaria o secondaria, ad esempio se un antigene, in un primo momento presenta una struttura secondaria che viene riconosciuta, ma in un secondo momento la perde, diventando una struttura primaria, qual determinato antigene non viene riconosciuto, oppure una struttura primaria se diventa secondaria può essere riconosciuta e così via con le altre strutture Le porzioni di antigene che vengono riconosciute come strutture primaria vengono anche detti Determinanti di Sequenza o Lineari, mentre gli antigeni che vengono riconosciuti grazie alla loro struttura secondarie, terziarie e quaternarie vengono dette 19

20 Determinati di tipo Conformazionale. Ad esempio esistono delle allergie verso alcuni componenti dell uovo come ad esempio una reazione allergica verso una componente proteica Termolabile o Termostabile presente nell uovo, esempio pratico se un bimbo è sensibile ad una proteina Termolabile probabilmente il bimbo potrà continuare ad assumente l uovo solo se sia cotto (detta ipersensibilità di primo tipo). Altra caratteristica di un antigene è la sua Forma Fisica la quale favorirà l immonogenicità in quanto se si presenterà sempre nella sua forma nativa favorirà l azione del sistema immunitario ma in alcuni casi se una determinata proteina si presenta nella sua forma denaturata cioè si presenta con una conformazione diversa dalla forma nativa, il sistema immunitario non la riconoscerà perché il sistema riconoscerà la forma nativa e non quella mutata. Per quanto riguarda la Degradazione dell antigene, per essere presentato, alle cellule del sistema immunitario (APC) l antigene deve essere Processato in componenti più piccoli detti Peptidi, ma se l antigene presenta una forma particolarmente resistente non potrà essere processata quindi presentata. Esistono anche dei fattori ti tipo Genetico che influenzano l immunogenicità come ad esempio tra specie differenti ci può essere una differenza nell immunogenicità cioè vuol dire che un determinato antigene verrà riconosciuto in una specie e non in un'altra specie, oppure all interno di individui appartenenti alla stessa specie, ci possono essere delle variazioni che rendono l individuo più o meno sensibile a quel particolare antigene. Come accennato, l antigene deve essere Processato e Presentato da molecole MHC (sono le proteine più variabili all interno di individui appartenenti alla stessa specie quindi individui della stessa specie possono rispondere in maniera differente all antigene esempio all interno di epidemie alcuni individui rispondono meglio di altri, questo grazie alla variabilità delle molecole MHC). Altro fattore è l Età, come menzionato il Timo va incontro a regressione e comporta che il numero di linfociti naive che possono essere prodotti diminuisce sempre di più inoltre, i linfociti naive che sono stati prodotti nel corso della vita dell individuo sono destinati a diminuire sempre più di numero, per cui l effetto della distruzione dei linfociti con la regressione del timo che regredisce possono portare ad una minore risposta immunitaria verso gli antigeni. 20

21 Un altro fattore che influenza l immunogenicità è la Dose dell antigene, nel caso di una risposta primaria è molto importante una dose che supera un determinato valore, quindi una antigene per essere aggressivo deve superare (calcolato in concentrazione) una certa soglia, ma e tale soglia va oltre soprattutto nella risposta secondaria, può provocare Tolleranza che può essere sia a basse dosi ad alte dosi. Lo studio della tolleranza è importante perché ci consente di creare delle buone dosi di vaccinazioni quindi di prevenire reazioni non volute verso gli allergeni (antigeni innocui), cioè inserendo il giusto quantitativo di allergene per avere una risposta efficace. Altro fattore che influenza l immunogenicità è l Introduzione dell antigene, la quale via preferita è quella sottocutanea o intramuscolare questo si effettua perché l antigene viene confinato in quella piccola zona, trovando delle cellule ACP molto specializzate che porteranno l antigene negli organi linfoidi secondari (linfonodi) mentre per quanto riguarda la somministrazione intravenosa è molto più diverso e l antigene raggiungerà gli organi linfoidi secondari molto più lentamente, in ultimo la via gastroenterica che è la via meno usata. Altro metodo per rendere il soggetto responsivo verso un determinato antigene è quello dell uso contemporaneo di sostanze che incrementano l immunogenicità definite Adiuvanti (sostanze che aumentano l effetto di un vaccino distinguendoli in adiuvanti Incompleti e Completi: Incompleto è il caso del metodo di Freund formato da un olio che viene emulsionato con l acqua dove si creano delle microvescicole dove viene intrappolato l antigene dove verrà rilasciato lentamente; mentre quello Completo, che aumenterà la sua efficacia nelle prime fasi dell immunizzazione, ci aggiungiamo microbatteri morti o porzioni di batteri che stimolano l immunità innata. Per cui avremo un doppio effetto: rendere l antigene parzialmente insolubile, il rilascio lento dell antigene, l attivazione, con porzioni di batteri, dell immunità innata inducendo Costimolazione che è il secondo segnale per l attivazione dei linfociti). Altro fattore che influenza l immunogenicità è la Natura Chimica, oltre alle proteine sono presenti anche gli Zuccheri (esempio mannosio) i quali sono riconosciuti direttamente dal linfociti B, oppure gli Acidi Nucleici possono fungere da immunogeni come in molte malattie dette connettiviti oppure i Lipidi. 21

22 Nella natura chimica non tutti gli antigeni vengono riconosciuti dalle stesse cellule come ad esempio antigeni che non hanno bisogno dell aiuto delle cellule T, chiamate anche Timo Indipendenti, cioè il sistema immunitario risponde indipendentemente dal coinvolgimento delle cellule T come i polisaccaridi la quale caratteristica si presenta con una struttura complessa ma i suoi residui riconosciuti del sistema immunitario è identico in tutta la struttura attivando i linfociti B dando inizio ad un attivazione policlonale, come i flagelli dei Gram + e Gram Gli antigeni T dipendenti sono le proteine che dovranno essere elaborate e presentate a i linfociti T dove il TCR va a riconoscere una specifica sequenza di aminoacidi quindi una fase importante del riconoscimento è denaturare la proteina, spezzettarla in peptidi quindi rendendola presentabile ai linfociti T mentre il linfocita B riconosce più aminoacidi contemporaneamente disposti in maniera lineare i linfociti T riconoscono solo piccole (7/11) sequenze di aminoacidi dove il TCR riconoscerà solo 2 o 3 aminoacidi all interno del piccolo frammento di aminoacidi. Grazie al singolo aminoacido il nostro sistema immunitario potrà riconoscere proteine Self che si sono alterate, come nel caso dei tumori dove una cellula tumorale crea proteine non self. Anche il peso molecolare influenza l immunogenicità. Le Immunoglobuline sono caratterizzate dei domini immunoglobulinici formati da due serie di strutture piatte di β shift intrecciate tenute da un ponte S-S. Queste strutture sono molto presenti nel panorama del sistema immunitario come: nelle immunoglobuline, nel recettore T, nelle molecole MHC, in alcune strutture recettoriali nel riconoscimento delle citochine, presenti in strutture che determineranno le selectine e le addressine. Le immunoglobuline sono strutture glicoproteiche altamente variabili. Il vantaggio strutturale delle immunoglobuline è che essendo compatte e semplici quando si interciano si rendono molto resistenti. La struttura di base di una immunoglobulina è formata da una coppia di catene Pesanti tenute assieme da un ponte S-S, ciascuna catena pesante è composta da almeno 4 domini globulinici. Attaccata a ciascuna catena pensante è presente una catena Leggera tenuta assieme da un ponte S-S. Inoltre all interno della struttura possiamo distinguere una zona Variabile amino terminale (pesante e leggere) e una zona Cotante CH terminale che 22

23 caratterizza le varie classi delle immunoglobuline. Al centro della molecola troviamo una regione molto flessibile detta Regione Cerniera, molto importante perché permetterà alle braccia dell immunoglobulina di aprirsi e chiudersi a seconda della distanza dei vari determinanti che deve riconoscere. La forza dell interazione viene definita Affinità, mentre la sommatoria delle affinità è definita Avidità, maggiore è la possibilità di interagire con più determinanti antigenici maggiore sarà la forza di interazione e maggiore sarà anche l avidità. Il singolo determinante antigenico è riconosciuto contemporaneamente dalle due estremità delle regioni variabili che sono formate da una porzione pesante e una porzione leggera. Ci sono immunoglobuline che possono interagire con due determinanti contemporaneamente presentando una bassa avidità, ma ci sono immunoglobuline che possono interagire con dieci determinanti antigenici come nel caso delle IgM quindi l avidità aumenta! Le immunoglobuline essendo delle strutture glicoproteiche i carboidrati rendono la struttura più stabile e meno degradabile e favoriscono determinate funzioni effettrici. I domini immunoglobulinici sono estremamente robusti, se usiamo la papaina va ad interagire con aminoacidi della catena pesante la quale si dividerà un tre porzioni, 2 porzioni Fab (formate da una catena pesante e una legera, frammento variabile) e 1 porzione Fc (formata da due catene pesanti, frammento costante) non più uniti da ponti S-S. Nel frammento (Fab), risiede la specificità dell'immunoglobulina, e quindi la sua capacità di reagire con l'antigene, mentre il frammento (Fc) attua le funzioni effettrici delle immunoglobuline (fissazione del complemento, recettori cellulari, etc.). Fc o facilmente cristallizzabile cioè la cristallizzazione di una proteina si può ottenere solo quando la struttura di una singola proteina è identica, quindi Fc è identica ma Fab non essendo identica non è cristallizzabile. Se si usa invece la Pepsina si formerà un unico frammento Fab2 (uniti da ponte S-S) e due frammenti Fc. Classi di immunoglobuline vengono prodotte inizialmente come IgM che è caratterizzata da immunoglobuline Pentameriche cioè una catena Ј tiene unite cinque immunoglobuline formando un'unica immunoglobulina con dieci residui riconoscendo dieci residui antigenici contemporaneamente. Una immunoglobulina M con alta avidità è necessaria perché quando viene prodotta inizialmente ha un affinità più bassa di una 23