Insorgenza precoce della senescenza cellulare in cellule endoteliali umane esposte a radiazioni ionizzanti di varia qualità.

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1 Insorgenza precoce della senescenza cellulare in cellule endoteliali umane esposte a radiazioni ionizzanti di varia qualità. L. Manti, M. Durante, G. Gialanella, G. Grossi, M. Pugliese, P. Scampoli Dipartimento di Scienze Fisiche, Università di Napoli Federico II & Sezione INFN di Napoli

2 Razionale-1 XIV Convegno Nazionale SIRR L obiettivo di ogni piano di trattamento antitumorale è la sterilizzazione del tumore; la tossicità a carico del tessuto sano limita la dose massima amministrabile dell agente antitumorale. La radioterapia, da sola o in associazione con agenti chemioterapici e/o radiosensibilizzanti, è efficace nella cura di molti tipi di neoplasie. Molti studi radiobiologici e clinico-epidemiologici esistono sul cancro radioindotto.

3 Razionale-2 XIV Convegno Nazionale SIRR Poco studiati sono gli effetti tardivi non tumorali della radiazione, specie di quella ad alto LET: Studi sui sopravvissuti giapponesi hanno dimostrato un incremento statisticamente significativo nell incidenza di patologie non tumorali (ad es. malattie cardiovascolari, diabete, etc.) Prolungate esposizioni al campo di radiazione spaziale provocano l insorgenza precoce di cataratta e di altre alterazioni non neoplastiche Da studi su animali è noto che la radiazione, in aggiunta ai danni acuti osservabili nei pazienti di radioterapia (eritemi, fibrosi etc), può causare degenerazioni tissutali e danni funzionali che si manifestano tardivamente.

4 Adronterapia per il trattamento dei tumori L uso terapeutico di protoni e ioni pesanti (adronterapia) presenta vantaggi rispetto alla terapia con fotoni (sia convenzionale che IMRT) Una distribuzione della dose fisica (curva di Bragg) caratterizzata da limitato straggling laterale e un picco modulabile del rilascio energetico (Spread-Out-Bragg Peak o SOBP) Proprietà radiobiologiche legate alla capacità degli ioni pesanti accelerati di causare danni al DNA difficilmente riparabili che si traducono in una maggiore efficacia biologica relativa (RBE) rispetto a fotoni e ioni leggeri per l inattivazione cellullare La dose biologicamente efficace può essere mantenuta costante lungo il SOBP

5 Scopo dell esperimento Dato l elevato RBE per la morte cellulare ed altri effetti cito- e genotossici acuti, è ragionevole supporre che gli ioni carbonio siano mediamente più efficaci dei fotoni o dei protoni anche per l induzione di effetti degenerativi a lungo termine, nonostante la significativa riduzione della dose assorbita nei tessuti sani. L adronterapia con ioni carbonio è stata utilizzata da circa 15 anni su poco meno di 3500 pazienti, quindi dati clinici attendibili sugli effetti tardivi non sono ancora disponibili. Lo scopo dell esperimento è studiare se, e con che efficacia rispetto ai raggi X, ioni carbonio di vario LET del fascio da 270 MeV/n utilizzato per l adronterapia al GSI in Darmstadt (Germania) inducono in cellule umane normali un insorgenza precoce della senescenza cellulare.

6 Senescenza cellulare-1 In vitro la senescenza è definita operativamente come l esaurimento della capacità proliferativa di una cellula somatica. Le cellule senescenti rimangono a lungo in cultura quiescienti ma metabolicamente attive e mostrano caratteristiche morfologiche e biochimiche precipue (aumento del volume ed appiattimento del citoplasma; modifiche dell espressione genica, etc.) L accorciamento dei telomeri al di sotto di una lunghezza limite porta all arresto irreversibile del ciclo cellulare (orchestrato dall oncosoppressore p53). In vivo diversi tessuti mostrano un accumulazione di cellule senescenti con l età; un rapido aumento del loro numero può favorire l instaurarsi di fenomeni degenerativi. Sembra esserci una corrispondenza inversa fra lunghezza telomerica media e progressione dei processi di invecchiamento tissutale e dell intero organismo.

7 Senescenza cellulare-2 Nelle cellule tumorali l enzima telomerasi sintetizza le sequenze telomeriche perse; è molto attiva nell 85% delle linee cellulari tumorali mentre è praticamente assente nella maggior parte dei tessuti umani normali. La senescenza fisiologica è vista come un efficace meccanismo oncosoppressore e quindi potrebbe essere controllata geneticamente: fibroblasti umani transfettati con oncogeni Ras manifestano senescenza prematura; la senescenza indotta da oncogeni gioca un ruolo contro la progressione tumorale in vivo.

8 Senescenza prematura In risposta a stress cito- e genotossici di entità sub-letale le cellule in vitro entrano prematuramente in senescenza (Stress-Induced Premature Senescence o SIPS) Il meccanismo non è chiaro; due percorsi molecolari sono stati ipotizzati : Uno, indipendente dai telomeri, attivato dal riconoscimento del danno al DNA (via p16/prb) e/o mediato da oncogeni: danni al DNA sembrano produrre attivazione di oncogeni implicati nell insorgenza di senescenza (RasV12, STAT5, E2F1, etc) L altro meccanismo è legato all accorciamento telomerico, come nel caso della senescenza fisiologica: è noto che il danno ossidativo al DNA provoca un accelerazione nella perdita delle sequenze telomeriche

9 Senescenza radioindotta La radiazione ionizzante a basso LET (raggi γ) promuove SIPS in cellule umane sia normali (fibroblasti) che tumorali (breast cancer) Nei fibroblasti la SIPS appare come la risposta preferenziale alla radiazione, è reversibile e non associata ad accorciamento telomerico; Nelle cellule tumorali la SIPS sembra non dipendere dall inibizione dell attività della telomerasi mentre nei fibroblasti l espressione ectopica della telomerasi non ne previene l insorgenza. In fibroblasti umani l esposizione in vitro a dosi subletali di un fascio misto di ioni ad alto LET è stata associata ad una riduzione del numero di divisioni cellulari. L induzione prematura di senescenza in cellule tumorali permetterebbe di raggiungere l obiettivo tumoricida a dosi subletali; l insorgenza di senescenza come danno collaterale nel tessuto sano potrebbe causare degenerazione tissutale ed instabilità genomica.

10 Schema dell esperimento Sistema cellulare: cellule endoteliali del cordone ombelicale umano (HUVEC) le HUVEC entrano in senescenza dopo un ben definito numero di duplicazioni o passaggi in coltura; la senescenza è fortemente correlata con la diminuzione della lunghezza media telomerica; Irraggiamento: due posizioni della curva di Bragg del fascio di carbonio: plateau (LET=13 kev/µm) e SOBP (LET=100 kev/µm); due dosi : 0.5 e 2 Gy; due dosi isoeffetto di raggi X usate come riferimento (1.75 e 3.5 Gy). Al primo passaggio post-irraggiamento si ripiastrano le cellule irraggiate in due flasche a densità uguali fra loro ma diverse a seconda della dose ricevuta. Ad intervalli di tempo regolari una flasca è usata per: test istochimico dell espressione della β-galattosidasi per la determinazione della senescenza cellulare: misura dell accorciamento telomerico relativo mediante il metodo della IQ-FISH. La flasca rimanente è usata per propagare la coltura.

11 Metodiche XIV Convegno Nazionale SIRR Test della β-galattosidasi: questo enzima è espresso peculiarmente da cellule senescenti; dopo trattamento specifico, le cellule senescenti presentano una spiccata colorazione verde. La frazione di cellule senescenti è calcolata come il rapporto fra le cellule positive per la β-galattosidasi ed il numero totale di cellule osservate in un numero congruo di campi casuali (> 1000 cellule in totale per punto sperimentale). IQ-FISH (Interphase Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization): sequenze specifiche di DNA marcate con sonde fluorescenti ibridizzano i telomeri (in rosso) e un centromero (in verde) di cellule in interfase. Considerando l intensità di fluorescenza centromerica un invariante cellulare ed essendo quella del segnale emesso dalle sonde telomeriche proporzionale alla lunghezza dei telomeri, il rapporto T/C fra le intensità dei due segnali (telomerico/centromerico) è proporzionale alla lunghezza media dei telomeri. Le immagini sono analizzate da un sistema automatico. Dai dati raccolti si realizzano gli istogrammi delle distribuzioni di intensità di fluorescenza. Dal confronto delle mediane delle distribuzioni T/C si determina la riduzione della lunghezza media telomerica a vari tempi post Counts Passage 3 (PDL=10)-Senescent cells= (1.3 ± Passage 11 (PDL=42)-Senescent cells = (29 irraggiamento T/C fluorescence intensity (arbitrary units)

12 Senescenza prematura radioindotta: dipendenza dalla dose e dal LET della radiazione 60 β-galactosidase stained cells (%) Control 1,75 Gy X-ray 3,5 Gy X-ray 0,5 Gy Plateau 2 Gy Plateau 0,5 Gy SOBP 2 Gy SOBP 0 Passage 3 Passage 5 Passage 9 Passage 11

13 Incidence of cellular senescence (%) XIV Convegno Nazionale SIRR Andamento della senescenza in funzione del Control 1,75 X numero rays di divisioni cellulari ,5 X rays Incidence of senescence (%) Incidence of senescence (%) Control 0,5 Gy Plateau 2 Gy Plateau Population Doubling Level Population Doubling Level Control 0,5 Gy SOBP 2 Gy SOBP Population Doubling Level

14 Correlazione tra senescenza e lunghezza telomerica XIV Convegno Nazionale SIRR Senescence (%) 60 Control 1.75 Gy X-rays Passaggio Gy X-rays 0.5 Gy Plateau 50 2 Gy Plateau 0.5 Gy SOBP 2 Gy SOBP Passaggio T/C ratio

15 Risultati XIV Convegno Nazionale SIRR La senescenza si manifesta molto precocemente e mostra una dipendenza temporale ciclica dalla qualità della radiazione e dalla dose. Si osservano: una prima fase in cui la SIPS è linearmente dipendente dalla dose e dal LET della radiazione; una fase intermedia in cui a LET maggiore corrisponde ancora una maggiore incidenza di SIPS ma con una dipendenza inversa, a parità di LET, dalla dose; una fase terminale in cui si ripropone l andamento iniziale. La SIPS persiste più marcatamente nella progenie di cellule irraggiate che in quella del controllo ma l importanza degli effetti dovuti al LET e alla dose si attenuano nel tempo. Esiste una sostanziale correlazione fra l accorciamento telomerico e SIPS, ma: in corrispondenza dell insorgenza precoce della senescenza non si osserva una significativa differenza nei valori del rapporto T/C; a passaggio avanzato, il rapporto T/C non rispecchia la dipendenza dal LET e dalla dose osservata nella frequenza di cellule senescenti: ai valori di T/C più bassi, ossia al maggiore accorciamento telomerico tendono a corrispondere le percentuali di senescenza minori.

16 Conclusioni e lavoro in itinere La radiazione induce molto efficacemente senescenza cellulare nel sistema modello delle HUVEC. E un fenomeno precoce e persistente con una marcata e complessa dipendenza dalla qualità della radiazione. A dosi e valori di LET confrontabili con quelli di interesse per il tessuto sano in adroterapia (0.5 Gy plateau) si registra un incidenza di senescenza prematura in media tre volte maggiore di quella fisiologica. L accorciamento dei telomeri potrebbe essere coinvolto nella SIPS come risposta non-letale alla radiazione ma non sembra nè accompagnarne l insorgenza precoce nè rifletterne la dipendenza dalla qualità della radiazione. Dati da un altro irraggiamento al GSI (aprile 2008) sono in analisi: dosi più basse sia di raggi X (0.5 Gy) che di ioni carbonio a basso LET (0.1 Gy plateau) sono state usate.