Analisi e purificazione di proteine

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1 Analisi e purificazione di proteine elettroforesi ultracentrifugazione cromatografia frammenti specifici sequenziamento struttura primaria contesto fisiologico livelli superiori funzione

2 Elettrofores i macromolecole cariche migrano in un campo elettrico in solvente non conducente con velocità ZeE u= η Z: numero di cariche per molecola e: 1.6x10-19C E: campo elettrico (volt/cm) η: coefficiente di attrito

3 µ= u E Mobilità elettroforetica LogM = a bx M: peso molecolare x: distanza percorsa nel gel Log M Elettroforesi su gel x gel sopprime le correnti convettive provocate da gradienti di temperatura funziona da setaccio molecolare

4 Condizioni denaturanti La miscela di proteine viene disciolta in: Sodio Dodecil Solfato (SDS) * + mercaptoetanolo [HS-CH2-CH2-OH]** 1 SDS / 2 residui amino acidici si legano alla catena principale carica negativa netta massa della proteina carica proteina-sds>>carica proteina nativa *Detergente anionico che spezza i legami non covalenti ** Riduce i ponti disolfuro

5 Figure 8-17 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

6 Figure 8-18a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

7 Elettroforesi su gel di poliacrilamide i gel di poliacrilamide sono chimicamente inerti varie dimensioni dei pori setaccio molecolare migliora l efficienza dell elettroforesi

8 Figure 8-18b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

9 Figure 8-19 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

10 Figure 8-20 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

11 Figure 8-20a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

12 Figure 8-20b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

13 Figure 8-21 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

14 Figure 8-22 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

15 colorazione con argento o con blu Coomassie 1 dalton = 1/12 massa del 12C = Kg amu : unità di massa atomica = massa del protone 1 amu = Kg

16 Sensibilità del metodo Blu Coomassie bande contenenti 0.1 µg di proteina argento bande contenenti 0.02 µg di proteina Si possono distinguere proteine che differiscono in massa di circa il 2% A: 40 kd circa 10 residui di differenza B: 41 kd

17 Focalizzazione isoelettrica pi = punto Isolelettrico = ph a cui la carica netta è zero citocromo C albumina pi = 10.6 pi = 4.8 elettroforesi in gradiente di ph (senza SDS) si possono separare proteine che differiscono tra loro di una sola carica

18 focalizzazione isoelettrica + elettroforesi su gel con SDS 1. focalizzazione isoelettrica elettroforesi orizzontale 2. gel con SDS elettroforesi orizzontale Massa macchie su 2 dimensioni Proteine di E.coli sono state separate > 1000 proteine in un singolo esperimento pi

19 Figure 8-23 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

20 Purificazione di proteine nella loro forma nativa (struttura 3D intatta) si sfruttano 1. dimensioni 2. solubilità 3. carica 4. affinità con molecole specifiche test per l attività catalitica test per la purezza (SDS)

21 1. Separazione mediante dialisi separazione delle proteine da molecole molto più piccole

22 1. Gel-cromatografia = cromatografia per filtrazione su gel insolubile, ma altamente idratato le molecole più piccole entrano nei granuli e le grandi no le grandi passano più velocemente

23 raccogliendo in tempi diversi all uscita della colonna si possono separare proteine di dimensioni diverse e con diversa solubilità

24 3. Cromatografia a scambio ionico ph=7 carica netta positiva attacco a COOcarica netta negativa nessuna interazione

25 4. Cromatografia di affinità esempio: Concanavalina A alta affinità per il glucosio colonna con glucosio la proteina si attacca il resto scorre aggiunta di glucosio liberazione della proteina G G proteina colonna G aggiunta glucosio colonna G proteina G G

26 Ultra-centrifugazione refrigerazione campione sedimentato vuoto motore

27 Fc = m ω 2r = m(1 v ρ )ω 2r v : volume specifico della proteina ρ : densità della soluzione fattore di galleggiamento v = velocità di sedimen. = costante = Fc m(1 v ρ )ω 2 r = = f f f : coeff. frizionale della proteina s = coeff. di sediment. [s] = Svedberg (S) m(1 v ρ = = 2 f ω r v 1S = sec )

28 Velocità di sedimentazione massa (a parità di forma e densità) (densità della molecola)-1 funzione (complicata) della forma (f ) funzione della densità della soluzione (ρ) vρ < 1 vρ = 1 vρ > 1 galleggiamento immobilità affondamento

29 Lisosomi Batteri Virus mosaico tabacco (4x104 kd) Ribosoma E.coli (2500 kd) RNA ribosomale (1100 kd) Fibrinogeno (330 kd) Emoglobina (68 kd) Ribonucleasi A (12.4 kd) La centrifugazione può essere usata per separare molecole con diversi coefficienti di sedimentazione 104 S

30 Esempio Molecola anticorpale: PM = 150 kd Ultracentrifuga: r = 8 cm, rivoluzioni/ min (rpm) Accelerazione centrifuga: 4.9 x 108 cm/s2 5 x 105 g se v (proteina) = 3.4 x 10-4 cm/s allora s = 7S

31 Sedimentazione all equilibrio Peso Molecolare (PM) centrifugazione a bassa velocità gradiente di concentrazione (sedimentazione bilanciata dalla diffusione) 2kT c2 m= ln (1 v ρ )ω c1 (r2 r1 ) m: massa proteina ci : concentrazioni a distanza ri dall asse di rotazione k: costante di Boltzmann T: temperatura

32 Sequenziamento per mezzo della degradazione di Edman concentrazione aa i. Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly scaldando a 110ºC in HCl 6N per 24 ore composizione in a.a. Asp: catena laterale acida: primo aa ad uscire si può individuare fino a 1 µg di un aa (=quantità presente in un impronta digitale) cromatografia a scambio ionico eluzione in funzione del ph

33 ii. identificazione del residuo amino terminale (a) marcatura con cloruro di dansile idrolisi può essere usato 1 sola volta (degradazione completa del peptide) (b) degradazione di Edman: rimozione di un a.a. alla volta dall estremità amino-terminale

34 Passi del sequenziamento a. b. c. d. e. f. composizione in a.a. rimozione alla Edman composizione in a.a. rimozione alla Edman composizione in a.a. e così via a-c Ala c-e Gly e così via 1Ala, 2Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg 2Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg 1Gly, 1Asp, 1Phe, 1Arg

35 Metodo di Edman Lunghezza massima 50 resisui perdita di attendibilità Tagli specifici con metodi chimici o enzimatici Reagente Taglio chimico Bromuro di cianogeno O-iodobenzoato Idrossilamina 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Taglio enzimatico Tripsina Clostripaina Proteasi dello Stafilococco Sito di taglio Lato carbossilico di residui Met Lato carbossilico di residui Trp Legami Asp-Gly Lato aminico di residui di Cis Lato carbossilico di residui Lys e Arg Lato carbossilico di residui Arg Lato carbossilico di residui Asn e Gln

36 Prima proteina sequenziata Sanger F., Tuppy H. (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates. Biochem. J. 49: Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-aminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi α-aminici e i gruppi α-carbossilici metodo costoso ed inefficiente DNA ricombinante