Biochimica delle proteine Prof. M. Bolognesi a.a. 2007/2008. Eloise Mastrangelo

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1 Biochimica delle proteine Prof. M. Bolognesi a.a. 2007/2008 Eloise Mastrangelo

2 Perché è importante determinare la struttura primaria delle proteine? 1. La conoscenza della sequenza amminoacidica delle proteine è essenziale per comprendere i loro meccanismi di azione 2. Il confronto fra le sequenze di proteine analoghe ha permesso di comprendere il funzionamento delle proteine e ha indicato collegamenti evoluzionistici fra le proteine e gli organismi che le producono 3. L analisi della sequenza amminoacidica ha portato ad importanti applicazioni cliniche poiché molte malattie sono causate da mutazioni legate ad un cambiamento amminoacidico nella sequenza proteica

3 1. Preliminari a. Denaturazione delle proteine b. Riduzione e alchilazione dei ponti disolfuro c. Determinazione delle subunità 2. Analisi dei segmenti a. Frammentare le subunità in peptidi b. Degradazione di Edman 3. Ricostruzione della sequenza a. Allineamento di sequenze b. Assegnazione disolfuri

4 1. Preliminari a. Denaturazione delle proteine Le proteine vengono denaturate in condizioni acide o basiche, a bassa concentrazione salina, a elevate temperature oppure usando agenti denaturanti come l UREA e lo ione guanidinio o detergenti come l SDS.

5 b. Riduzione e alchilazione dei ponti disolfuro Serve per prevenire la conformazione nativa della proteina che può ostruire l azione degli agenti proteolitici usati nella determinazione della struttura primaria Agente riducente: Agente riducente: -2-mercaptoetanolo -ditiotreitolo -ditioeritritolo

6 Reazione di riduzione dei ponti disolfuro con 2-mercaptoetanolo H S S NH H + 2 HS H2 H NH H SH NH + HS H + H S S H NH

7 Agente alchilante: -acido iodioacetico Reazione di alchilazione delle cisteine H SH + I - H S - + HI NH NH

8 c. Determinazione delle subunità L identificazione dei residui N- e - terminali permette di stabilire il numero di subunità (catene polipeptidiche) da cui è costituita una proteina. Identificazione del residuo N-terminale: - dansil cloruro

9 Separazione, purificazione e caratterizzazione delle subunità Se una proteina risulta costituita da più subunità, queste devono essere separate usando i metodi di purificazione quali IE, GF, ecc. e caratterizzate mediante SDS-PAGE o spettrometria di massa per stabilirne il peso molecolare

10 Identificazione del residuo -terminale: Non esistono procedure paragonabili a quelle della determinazione del residuo N-terminale. Esistono enzimi che tagliano al -terminale, come le carbossipeptidasi. Le carbossipeptidasi tagliano al -terminale con una velocità che dipende dal tipo di amminoacido e che è indipendente dalla posizione dell amminoacido nella sequenza. Esistono metodi chimici per identificare i residui -terminali, quali l idrazinolisi, mediante l uso di idrazina. Tale processo è però soggetto a molte reazioni secondarie.

11 2. Analisi dei segmenti a. Frammentare le subunità in peptidi iascuna subunità può essere frammentata in peptidi sia enzimaticamente sia chimicamente. In entrambe i casi il processo di cleavage deve essere completo e altamente specifico in modo tale che la sequenza dei frammenti peptidici, quando correttamente riordinati, è quella della subunità intatta.

12 leavage con Tripsina Reazione di cleavage con Tripsina N Lys (or Arg) N L RP HPL è diventata la procedura di routine per la separazione di peptidi. Tripsina H N H H N H H N H - + +H 3 N H R R

13 Frammentazione con NBr Met H 3 H 3 S Br N Br - + S N H N H H N H HN H HN H R R H 3 H N H + Peptidil omoserina lattone H N H S + N Metiltiocianato + H 3 N 3 H N H R R

14 b. Degradazione di Edman Una volta ottenuti frammenti peptidici manegevoli, la sequenza amminoacidica può essere determinata mediante cicli ripetuti della degradazione di Edman RP HPL UV detector Possono essere identificati residui N-terminali di peptidi lunghi fino a amminoacidi prima che gli effetti di reazioni incomplete, di reazioni non specifiche e di perdita di peptidi facciano si che l identificazione amminoacidica non possa essere completabile.

15 1. Il reagente di Edman, fenilisotiocianato (PIT), reagisce con il gruppo amminico N-terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il feniltiocarbamile (PT) 2. Tale addotto è trattato con acido trifluoroacetico (F 3 H) anidro, che libera il residuo N-terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, senza idrolizzare gli altri legami peptidici 3. Il derivato tiazolinone-amminoacido amminoacido è estratto selettivamente con un solvente organico ed è convertito nel più stabile derivato feniltioidantoina (PTH) mediante trattamento con un acido in soluzione acquosa

16 Identificazione del PTH-aa N-terminale mediante cromatografia Il tipo di amminoacido è identificato con una cromatografia per mezzo di amminoacidi standard di riferimento

17 3. Ricostruzione della sequenza a. Allineamento di sequenze L allineamento di sequenza viene fatto mettendo a confronto le sequenze amminoacidiche di un set di frammenti peptidici con quelli di un secondo set i cui siti di cleavage si sovrappongono con quelli del primo set. La proteina viene ridotta prima del cleavage! Ad es. Primo set di peptidi ottenuti con Tripsina (che taglia Lys/Arg al terminale) Secondo set di peptidi ottenuto con NBr (che taglia Met al terminale)

18 Determinazione del segmento -terminale

19 Ricostruzione della sequenza M

20 Sequenza finale

21 b. Assegnazione disolfuri Lo step finale nell analisi della sequenza amminoacidica è quello di determinare la posizione dei ponti disolfuro. Si taglia la proteina (ad es. con Tripsina) in forma nativa non ridotta per mantenere intatti i ponti disolfuro A B

22 Separiamo i peptidi ( A e B) mediante HPL Determiniamo le sequenze N-terminali di ciascun peptide?

23 Si determina, mediante la conoscenza della sequenza amminoacidica, in quale peptide ci sono due isteine e si sceglie una seconda proteasi (o NBr) che taglia in due il peptide contenente le due cisteine

24 Struttura finale della proteina con i ponti disolfuro SequencingMaster.swf