Individuazione ed analisi delle mutazioni

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Vittoria Micheli
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1 Individuazione ed analisi delle mutazioni

2 La mutazione è un cambiamento ereditabile del materiale genetico Somatica Ereditata solo dai discendenti di una cellula Germinale trasmessa attraverso le generazioni gamete 1 individuo mutato staminale Molti individui mutati

3 L utilità delle mutazioni per studiare il processo della mutazione in quanto tale per dissezionare geneticamente i processi biologici (isolare i geni coinvolti in un dato processo biologico)

Differenza tra genetica e biologia molecolare La genetica formale studia i geni dall esterno consente di dedurre le funzioni selvatiche dei geni dall

4 Differenza tra genetica e biologia molecolare La genetica formale studia i geni dall esterno consente di dedurre le funzioni selvatiche dei geni dall analisi di fenotipi mutanti La biologia molecolare studia i geni a livello del DNA verifica le ipotesi fatte con la genetica formale sul ruolo dei geni

5 I tipi di mutazioni mutazioni morfologiche mutazioni letali mutazioni condizionali mutazioni biochimiche mutazioni con perdita di funzione mutazioni con acquisto di funzione

6 Mutazioni morfologiche alterano le caratteristiche esteriori di un organismo come la forma, il colore, le dimensioni. Mutazioni letali mutazioni in geni essenziali che provocano la morte degli individui

7 Mutazioni condizionali Un mutante condizionale presenta il fenotipo mutante solo in un ambiente particolare (condizione restrittiva), mentre presenta il fenotipo selvatico in un ambiente diverso (condizione permissiva) Mutanti temperatura-sensibili Mutazioni biochimiche Alterano la capacità di un organismo di sintetizzare una particolare molecola essenziale per la crescita Mutanti auxotrofi incapaci di crescere su terreno minimo Facilmente identificabili nei microrganismi (E.coli) e lievito

8 mutazione nulla (con perdita di funzione) m Mutazioni con perdita di funzione mutazione con parziale perdita di funzione m 1 Ipomorfe o nulle mutazione con acquisto di funzione M Mutazioni con acquisto di funzione neomorfe

9 Mutazione e retromutazione mutazione in avanti = cambiamento che porta un allele verso una forma diversa da quella selvatica reversione= cambiamento che ripristina il fenotipo selvatico retromutazione o soppressione stesso gene sequenza originaria altro gene o siti diversi dello stesso gene separabili

10 Mutazioni geniche (puntiformi) transizioni = sostituzioni di una purina con un altra purina o di una pirimidina con un altra pirimidina transversioni = sostituzioni di una purina con una pirimidina e viceversa

11 Tipi di mutazione:

14 Come si originano le mutazioni? Errori nella replicazione del DNA Cambiamenti chimici spontanei Elementi genetici trasponibili

15 Errori nelle replicazione del DNA Ogni base può comparire con forme isomeriche diverse chiamate tautomeri che differiscono rispetto alle posizioni degli atomi e dei legami atomici. Queste forme possono formare appaiamenti illeggittimi (es. A-C) Durante la replicazione del DNA appaiamenti errati possono creare mutazioni per sostituzione di coppie di basi

16 Cambiamenti chimici spontanei

17 I Trasposoni Gli elementi trasponibili o trasposoni sono sequenze che si spostano da un sito genomico ad un altro. Di conseguenza possono causare mutazione nei siti in cui si inseriscono In Drosophila alcuni trasposoni (P ed I) possono essere mobilizzati mediante opportuni incroci genetici.

18 Tasso di mutazione = numero delle mutazioni che si verificano in una certa unità di tempo Frequenza di mutazione = frequenza con cui una specifica mutazione compare in una popolazione di cellule o individui (la popolazione può essere costituta da gameti o qualsiasi altro tipo cellulare)

19 Dannose, ma non sempre Fonte di variabilita essenziale per l evoluzione L ambiente induce specifiche mutazioni o le seleziona? Esempi: Biston betularia e resistenza agli antibiotici o ai virus Da Lamarck a Darwin.

20 La resistenza Infezione di E. coli col fago T1 provoca la lisi della maggior parte delle cellule. Solo le cellule che hanno acquisito resistenza nei confronti del fago non vengono lisate. La resistenza si acquisisce spontaneamente o è indotta dall esposizione al fago? Esperimenti di Lederberg utilizzando il sistema del replica-plating (1952)

21 Tecnica del replica plating Batteri piastrati su terreno solido minimo addizionato di arginina formano colonie. Si fa una replica su terreno minimo (non contenente arginina) e si paragonano le colonie con la piastra madre Le colonie assenti sulla replica ma presenti sulla piastra madre saranno i mutanti arg-

22 I mutanti erano presenti già prima della esposizione al fago? (Lederberg 1952)

23 Le colonie mutanti erani già presenti sulla piastra madre

24 Se le mutazioni si fossero verificate dopo l esposizione al fago ogni replica sarebbe stata diversa quanto a distribuzione delle colonie resistenti

25 Le mutazioni sono rare pertanto occorre una strategia per metterle in evidenza usare sistemi selettivi (tecniche realizzate per facilitare l isolamento di tipi mutanti desiderati dal resto degli individui) elevare il tasso di mutazione con l uso di mutageni

Il cromosoma ClB di Drosophila HJ Muller nel 1928 costruì un particolare tipo di cromosoma X che consentiva di mettere in evidenza mutazioni letali recessive spontanee ad esso

26 Il cromosoma ClB di Drosophila HJ Muller nel 1928 costruì un particolare tipo di cromosoma X che consentiva di mettere in evidenza mutazioni letali recessive spontanee ad esso legate. Il cromosoma ClB contiene un inversione che sopprime il crossing over (C), una mutazione letale recessiva (l) e il marcatore fenotipico dominante Bar (B). letale Inversione C Bar

27 Il comportamento dei letali X-linked

28 Come funziona il ClB Il cromosoma ClB è un cromosoma bilanciatore!

29 Muller trovò una frequenza di mutazione spontanea di 1,5 per 1000 cromosomi. Per aumentare questa frequenza irradiò con i raggi X (1000 roentgen) i maschi e trovò una frequenza dell 1,7%

30 Relazione lineare tra la dose dei raggi X somministrata in Drosophila e la % di mutazioni letali recessive associate al sesso

31 Non esiste una dose di radiazioni che non produce mutazioni! % di mutazioni dose di radiazioni

32 I MUTAGENI Mutageni fisici radiazioni ionizzanti (raggi cosmici. raggix, raggi γ) radiazioni ultraviolette Mutageni chimici analoghi delle basi (5-Bromouracile) agenti che modificano le basi: agenti deaminanti (acido nitroso); agenti idrossilanti (idrossilammina); agenti alchilanti (EMS, MMS). agenti intercalanti (acridina orange, proflavina, bromuro di etidio)

33 Incorporazione di analoghi delle basi Il 5-Bromouracile è un analogo della Timina con un atomo di Bromo al posto di un CH3. Passa frequentemente alla forma enolica e si appaia con la Guanina

34 La 2-amminopurina è un analogo della Adenina. Si appaia con la Timina. Se è protonata si appaia con la Citosina

37 Gli agenti alchilanti (Etilmenansulfonato, Metilmentansulfonato e Nitrosoguanidina) modificano le basi aggiungendo gruppi alchilici

38 Agenti intercalanti provocano l inserzione o la delezione di una base

40 Nelle cellule ci sono sistemi enzimatici che riparano i danni subiti dal DNA Alcune malattie sono attribuite a difetti di riparazione del DNA

41 Riparazione diretta Riparazione dei dimeri di Timina causata da raggi UV L enzima fotoliasi in presenza di luce ripara il danno

42 Riparazione diretta Le alchiltransferasi rimuovono i gruppi alchilici addizionati dai mutageni

43 Riparazione per escissione 1. rottura di un legame fosforico (endonucleasi) 2. escissione di un tratto di DNA 3. sintesi riparativa (DNA polimerasi) 4. saldatura delle estremita ad opera di una ligasi

44 Riparazione ricombinativa

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