DETERMINAZIONE DELLA CAPACITÀ DI UN PREPARATO ENZIMATICO DI ROMPERE LE CATENE PECTICHE TRAMITE LA MISURAZIONE DELLA VISCOSITÀ

Transcript

1 RISOLUZIONE OIV/ENO 351/2009 DETERMINAZIONE DELLA CAPACITÀ DI UN PREPARATO ENZIMATICO DI ROMPERE LE CATENE PECTICHE TRAMITE LA MISURAZIONE DELLA VISCOSITÀ L'ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell organizzazione internazionale della vite e del vino, Su proposta della Sotto-Commissione «Metodi di analisi» e del gruppo di esperti «Specifiche dei prodotti enologici», DECIDE, su proposta della commissione II «Enologia», di integrare il Capitolo II della Farmacopea enologica internazionale con le seguenti tecniche analitiche e di controllo: 1. PRINCIPIO Ci si propone in questa sede di misurare la quantità di enzima necessario per ridurre della metà la viscosità di una soluzione standard, in condizioni determinate di ph, di temperatura e di tempo. E una misurazione puramente tecnologica destinata a provare l efficacia chiarificante reale dell enzima. Rende conto essenzialmente dell attività pectinasi che non può essere dedotta direttamente dalla liberazione dell acido galatturonico nel mezzo. Nota Per misurare l attività dell enzima, si possono adottare due approcci: - Sia il tempo che impiega una data concentrazione di enzima affinché la viscosità della soluzione di pectina diminuisca della metà, - Sia la concentrazione necessaria di enzima affinché la viscosità della soluzione di pectina diminuisca della metà in un determinato tempo. Test dimostrano che, finché il substrato non è limitante: - nel primo caso, il logaritmo della viscosità (tempo di scorrimento) è inversamente proporzionale al tempo di reazione e, - nel secondo caso, il logaritmo della viscosità è inversamente proporzionale alla quantità di enzima nell ambiente. In un caso come nell altro, è facile trovare sia il tempo, sia la quantità di enzima necessaria per ridurre la viscosità della metà a partire da una curva oculatamente scelta. OIV /6

2 2. CONDIZIONI DELLA REAZIONE Ambiente tampone fosfato 70 mmol/l e citrato 30 mmol/l Substrato: Pectina di mela esterificata al % (per es.: Sigma P 8471), diluita a 10 g/l nel tampone. ph = 3,5 Temperatura: 30 C reazione: 15 minuti. Pectinasi: gamma di concentrazioni che racchiudono circa 10 mg/l di peso secco di enzima nel campione, per esempio 0,5 mg nei 50 ml di substrato. Questo corrisponde alla quantità di enzima in grado di fare diminuire la viscosità del substrato della metà in 15 minuti nelle condizioni descritte qui sopra. 3. APPARECCHIATURA 3.1 Termostato a bagno o a circolazione d acqua a 30 C ± 1 C 3.2 Viscosimetro a scorrimento (A.3.1: Fig. 2) con un valore d acqua vale a dire il tempo di scorrimento dell acqua tra i due contrassegni da 18 a 20 secondi circa (ossia un capillare del diametro compreso tra 0,5 e 0,6 mm circa) 3.3 Cronometro 3.4 Bilancia analitica (precisione 0,001 g) 3.5 ph-metro 3.6 Agitatore magnetico, vetreria tradizionale di laboratorio. 3.7 Filtri rapidi in carta 3.8 Micropipette o microsiringhe che permettono di iniettare volumi da 5 a 500 µl. 4. PRODOTTI PURI 4.1 Acido citrico puro (99,5 %) 4.2 Idrogenofosfato di sodio diidrato puro (Na 2 HPO 4 2H 2 O) (99,0 %) 4.3 Pectina di mela esterificata al % di purezza superiore al 90 % (per es.: Sigma P 8471), 4.4 Acqua distillata o deionizzata 4.5 Idrossido di sodio puro (98 %) 4.6 Acido cloridrico puro (11,5 M) (33,5 %) 4.7 Pectinasi della quale occorre misurare l attività. 5. SOLUZIONI Ogni soluzione deve sempre sempre omogeneata prima dell uso 5.1 Idrossido di sodio 2 M Pesare 80 g di idrossido di sodio puro (4.5) in un matraccio graduato da 100 ml, sciogliere nell acqua deionizzata (4.4) e portare a volume dopo la dissoluzione completa e il raffreddamento. 5.2 Acido Cloridrico 2 M In una fiala graduata da 100 ml riempita a metà con acqua deionizzata mettere la quantità sufficiente di acido cloridrico puro (4.6) per ottenere una soluzione finale 2 M, (dopo aver portato a volume) OIV /6

3 5.3 Tampone fosfato 47 mmol/l, citrato 53 mmol/l, ph 3, Mettere 800 ml di acqua deionizzata (4.4) in un pallone graduato da 1000 ml Pesare 11,22 g d'acido citrico (4.1) Pesare 8,30 g di idrogenofosfato di sodio diidrato puro (Na 2 HPO 4 2H 2 O) (4.2) Trasferire i prodotti chimici pesati quantitativamente nel pallone graduato da 1000 ml sempre rimescolando Mescolare fino all intera dissoluzione Aggiustare il ph a 3,50 ± 0,05, alla temperatura ambiente, con idrossido di sodio 2 M (5.1), o acido cloridrico 2 M (5.2) secondo il ph iniziale Portare a volume con acqua deionizzata (4.4). Mescolare Stabilità: 8 giorni a temperatura ambiente Substrato: Pectina di mela (4.3), Mettere un recipiente cilindrico da 400 ml in un bagno d acqua regolato a 40 C ± 3 C su un agitatore rotante Aggiungere 250 ml di tampone a ph 3,5 (5.3), esattamente misurato, nel recipiente cilindrico Agitare delicatamente a 40 C Pesare 2,500 g ± 0,01 g di pectina (4.3) Aggiungere lentamente la pectina agitando energicamente Poi agitare lentamente per 60 minuti mantenendo la temperatura a 40 C Smettere di rimescolare e raffreddare a 30 C ± 3 C Filtrare su carta filtro rapida (3.8) se necessario (presenza di grumi) Stabilità: 24 ore a temperatura ambiente. 5.5 Soluzione di pectinasi a 100 g/l di peso secco (4.7) Pesare 2,50 g ±0,01 g di pectinasi in polvere o granulato Trasferire in un pallone graduato da 25 ml Portare a volume con iltampone a ph 3,5 (5.3) Sciogliere per agitazione per 20 minuti su agitatore magnetico Filtrare su carta filtro rapida se l enzima è immobilizzato su un materiale insolubile con l aiuto di un filtro rapido Nel caso di preparazione enzimatica liquida, utilizzare direttamente quest ultima. Stabilità: 4 ore a temperatura ambiente. 6. MISURE 6.1 Mettere il viscosimetro nel bagno d acqua a 30 C o utilizzare qualsiasi dispositivo che permetta di misurare la viscosità a 30 C. 6.2 Misurare la viscosità (in effetti il tempo di scorrimento tra i due tratti del viscosimetro) della soluzione tampone a ph 3,5, ovvero t o. Questo tempo deve essere vicino ai 20 secondi per un capillare da 0,5 a 0,6 mm di diametro. 6.3 Misurare il tempo di scorrimento della soluzione di pectina a 10 g/l ossia T p, questo tempo deve essere dell ordine di 200 secondi o più. 6.4 Preparare una serie di 4 palloni graduati contenenti 50 ml di pectina da 10 g/l, metterli in un bagno d acqua a 30 C. 6.5 Aggiungere nel primo pallone 5µl della soluzione di enzima avente concentrazione 100 g/l, omogeneizzare. Poi, ogni 15 minuti circa, aggiungere successivamente negli altri palloni: 15 µl, 35 µl e infine 100 µl della soluzione di enzima avente concentrazione 100 g/l, omogeneizzare. OIV /6

4 6.6 Cronometrare il tempo di scorrimemento delle differenti soluzioni tra i due tratti del viscosimetro esattamente 15 minuti dopo l aggiunta di enzima. 7. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEI VALORI MISURATI Detrarre dal tempo di scorrimento il valore t o corrispondente al solo tampone con ph 3,5. Tracciare il grafico rappresentante il logaritmo del tempo di scorrimento in funzione della concentrazione dell enzima. Devono esserci almeno tre punti allineati corrispondenti alle diluizioni più forti. Se questo non avviene, utilizzare una soluzione di enzima più diluita, per esempio a 50 g/l o anche a 10 g/l. 8. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Ricercare l equazione della retta di regressione passante per i tre punti allineati: T = ax + b Da essa dedurre la concentrazione di enzima C necessaria perché la viscosità della soluzione di pectina diminuisca della metà (T p - t o )/2 ovvero T 0,5. 9. ESEMPI 9.1 Determinazione della concentrazione di enzima necessaria perché la viscosità della soluzione di pectina diminuisca della metà. (Tabella 1) scorrimento del solo tampone t o = 19,3 s Tabella 1: Vol (µl) di enzima con 100g/l /50 ml di pectina Concentrazione (g/l) scorrimento (s) Tempo corretto (s) Log Tempo corretto (Tp) 210,7 (Tp - to) 2,32 5 0, ,7 2, , ,7 1, ,2 32,8 13,5 1, ,8 4,5 0,65* Tempo corretto = tempo di scorrimento tempo di scorrimento del tampone con ph 3,5 * valore non considerato equazione della retta di regressione (fig. 1) y = -5, ,2844 (T p - t o ) /2 = 105 s. Log 105 = 2,02 C = (2,28-2,02)/5,84 = 0,044 Occorrono quindi 0,044 g/l di enzima per diminuire della metà la viscosità di una soluzione di pectina di mela con concentrazione 10 g/l a 30 C per 15 minuti. Si constata che 1 g/l di enzima ha permesso di ridurre praticamente del tutto la viscosità della soluzione di pectina in 15 minuti. OIV /6

5 Log tempo di scorrimento 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 y = -5,8366x + 2, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Enzima (g/l) Fig.1 Diminuzione della viscosità di una soluzione di pectina in funzione della concentrazione in enzima 9.2 Riduzione della viscosità di una soluzione di pectina alla concentrazione di 10 g/l in funzione del tempo di reazione a 30 C di un enzima alla concentrazione di 0,1 g/l. (fig. 2) A titolo di informazione Il tempo di scorrimento del tampone è di 19,6 s. Tabella 2: reazione (mn) scorrimento (s) scorrimento corretto* (s) Log del tempo di scorrimento (T p ) 150,7 (T p - t o ) 2,18 11,5 101,4 82,1 1,91 15, ,7 1,82 21,08 72,8 53,5 1, ,83 40,53 1,61 40,31 48,79 29,49 1, ,08 20,78 1, ,25** 12,95 1, ,25** 6,95 0,84 * scorrimento corretto **valori non presi in considerazione, in quanto la quantità di pectina rimanente limita la reazione OIV /6

6 Tem po di scorrimento reazione (min ) Log tempo di scorrimento 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 y = -0,0197x + 2,1546 1, reazione (min) Fig. 2. Evoluzione della viscosità di una soluzione di pectina da 10 g/l in funzione del tempo di reazione di un enzima a 0,1 g/l a 30 C Fig.3. Evoluzione della viscosità di una soluzione di pectina da 10 g/l in funzione del logaritmo tempo di reazione di un enzima a 0,1 g/l a 30 C. Interpretazione dei risultati I valori della tabella 2 dimostrano che occorre una durata di reazione T/2 di 13,3 minuti per ridurre della metà la viscosità della soluzione di pectina da 10 g/l a 30 C. Con il calcolo, a partire dalla retta di regressione della fig. 3: Log75,35 = 1,877 da cui T 0 /2 = (2,1545-1,877 )/0,0197 =14,1 minuti. 10. BIBLIOGRAFIA Bertrand A. détermination de la capacité d'une préparation enzymatique de type polygalacturonase a couper les chaines pectiques par la mesure de la viscosité. OIV FV OIV /6