UNIVERSITA DEGLI STUDI DEL SANNIO

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DEL SANNIO FACOLTA DI SCIENZE MM. FF. NN. CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE Tesi di Laurea di Primo Livello in Biochimica La Micosi Fungoide:approccio integrato clinico-patologico e molecolare alla diagnosi precoce. RELATORE: CANDIDATA: Chiar.mo Prof. Marina Piccirillo Francesco Paolo Mancini Matr. 154/ CORRELATORE: Dott. Gerardo Ferrara ANNO ACCADEMICO 2008/2009

2 1.1 Eziopatogenesi dei linfomi cutanei L eziopatogenesi dei linfomi cutanei è a tutt oggi non ancora del tutto chiarita. Similmente ad altre forme linfonodali ed extralinfonodali, è stato proposto per i linfomi primitivi cutanei a cellule T un ruolo di: -agenti infettivi, batterici (Borrelia burgdorferi) o virali (EBV; HTLV), - citochine tissutali (IL-2; IL-7; IL-10; IL-13; IL-15; TGF- ), - oncogeni (P53, Tal-1, Lyt-10) (dimostrati solo in casi di estrema aggressività clinica), -fattori ambientali/occupazionali (attraverso la persistente attivazione delle cellule di Langerhans, principali stimolatrici dei linfociti T). Nei pazienti con la MF le cellule T sono tipicamente cellule T helper memoria mature CD4+. Nella normale omeostasi della cute, queste cellule T sono reclutate per la cute in seguito a una qualunque noxa patogena. In risposta a questa, i cheratinociti rilasciano citochine che innescano una risposta immunitaria innata da parte delle cellule immuni residenti della cute, come ad esempio mastociti e macrofagi. Questa risposta può essere mediata da componenti di organismi patogeni ( CpG-oligodeossinucleotidi batterici )[CpG-ODN], componenti della parete cellulare, DNA e RNA virali ) che sono riconosciuti dai PRR ( pattern-recognition receptors), in particolare i recettori Toll-like (TLR), su queste cellule. I risultati a valle dell attivazione di questa via, basata sulla up-regulation di NF-κB sono risposte proinfiammatorie che hanno effetti diretti sugli agenti patogeni e comportano un ulteriore 8

3 reclutamento delle cellule infiammatorie e la migrazione di cellule presentanti l antigene (APCs) attivate ai linfonodi locali della cute drenante. Una volta che le APCs incontrano le appropriate cellule T naive nei linfonodi, si chiama in azione la sorveglianza immunitaria: le cellule T diventano effettori antigene-specifici / cellule memory e acquisiscono la capacità di dirigersi verso il sito originale di infiammazione, la cute. Le principali cellule T memory antigenespecifiche vengono generate successivamente e ricircolano attraverso i linfonodi per fornire una riserva a lungo termine per la specifica sorveglianza immunitaria. Questi effettori della cute /cellule T memory esprimono CLA (cutaneous lymphocyte antigen) e normalmente costituiscono il 30% di tutte le cellulet memory circolanti. Le cellule T CLA-positive con homing specifico per la cute possono interagire con il recettore E-selectina sulle venule postcapillari cutanee. Queste cellule CLA+ tipicamente esprimono anche CCR4 (CC-chemokine receptor 4), che si lega alle chemochine prodotte a livello cutaneo CCL17(chemokine CC-chemokine 17; nota anche come TARC) e CCL22 (conosciuta anche come MDC). Tutte queste interazioni sono essenziali anche per il rolling delle cellule T sull endotelio, che è necessario ad esse per entrare nel derma e l epidermide. Si ritiene che tali skin-homing T cells non solo possano rispondere ad una infiammazione della cute, ma possano anche dirigersi costitutivamente verso la cute. L equilibrio tra le appropriate risposte difensive della cute e quelle inappropriate o disregolate sembra essere la chiave per comprendere la 9

4 patogenesi di dermatosi infiammatorie e proliferative, inclusa la MF. Le cellule T maligne nella MF esprimono gli skin-homing receptors CLA e CCR4. (Figura 1) 10

5 Figura 1 - Il microambiente cutaneo nella progressione della MF A) CUTE NORMALE CHE MOSTRA CELLULE DI LANGERHANS RESIDENTI NELL EPIDERMIDE E SKIN- HOMING T CELLS NEL DERMA E NELLA CIRCOLAZIONE, B) STADIO A CHIAZZA E A PLACCA DELLA MF NEL QUALE CELLULE T CD4+ MALIGNE,RISIEDONO NELL EPIDERMIDE E SI RACCOLGONO INTORNO LE CELLULE DI LANGERANS. E DA NOTARE CHE,IN QUESTI STADI,L INFILTRATO DERMICO ED EPIDERMICO HA FREQUENTEMENTE ABBONDANTI CELLULE T CD8+ COME PARTE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA., C) STADIO TUMORALE DELLA MICOSI FUNGOIDE,NEL QUALE IL TUMORE OCCUPA IL DERMA E I TESSUTI SOTTOCUTANEI E COMPRENDE PRINCIPALMENTE CELLULE T MALIGNE E POCHE CELLULE T CD8+, D) MF ERITRODERMICA CON PRESENZA DI CELLULE T MALIGNE CIRCOLANTI CHE ELABORANO CITOCHINE Th2 CHE COLPISCONOCELLULE CD8+,CELLULE NK, DC, E DI CONSEGUENZA LA RISPOSTA IMMUNE DELL OSPITE. 11

6 Inoltre, le lesioni di MF presentano elevati livelli di CCL17 e CCL22. Altre chemochine espresse da skin-infiltrating T cells trovate nelle lesioni di MF, come il recettore per chemochine CXC-3 (CXCR3) e CXCR4 e molecole di superficie, come l integrina αe β7, hanno i corrispondenti ligandi espressi dai cheratinociti epidermici e dalle cellule di Langerhans. I loro livelli di espressione sembrano correlati con le lesioni in stadio iniziale e possono rappresentare una risposta dell ospite alla neoplasia, poiché le lesioni in stadio tumorale perdono spesso l'espressione di questi marcatori: ciò spiegherebbe perché si può osservare minore aggressione sull epidermide (epidermotropismo) nelle biopsie della cute nelle forme avanzate di MF. In uno studio che confrontava l'espressione del recettore delle chemochine nelle diverse fasi di MF è stato dimostrato che nel tessuto è diminuito il livello di espressione del CCR4 o il CXCR3, ma è aumentato il livello di CCR7, il recettore necessario per l homing dei linfociti. L immunoistochimica e gli studi ultrastrutturali hanno dimostrato che i microascessi di Pautrier reperto istopatologico diagnostico di MF - è costituito da aggregati di cellule T maligne in contatto con le cellule di Langerhans. A seguito di queste osservazioni, il ruolo potenziale delle cellule di Langerhans nella patogenesi di MF/SS è stato studiato in modo approfondito. Le cellule del Langerhans intraepidermiche possono essere fonte di una persistente stimolazione antigenica per le cellule T, con conseguente attivazione e la successiva espansione clonale. Lo stato di attivazione delle cellule T maligne in MF / SS è evidenziato dalla fosforilazione costitutiva di Stat3. Inoltre, queste cellule T esprimono 12

7 CD45RO e possono esprimere anche CD25, il recettore per l IL-2α. Tuttavia, nelle fasi più avanzate di MF, la forma solubile del recettore per l IL-2 (sil-2r) può essere rilevata nel sangue periferico ed è stato dimostrato come un importante fattore prognostico negativo. Anche se non si sa quello che dà origine alla attivazione costitutiva di una popolazione di cellule T CD4+ con homing cutaneo nella MF, questa attivazione può derivare da un alterata espressione della citochina Th2 in corso di malattia infiammatoria e conseguente disregolazione immunitaria. Nei pazienti, questo profilo Th2 può contribuire alla progressione della malattia attraverso la produzione di IL-4 e IL-10, che compromettono la capacità immunocompetente dell ospite. Le cellule T CD4 + maligne, osservate nella maggior parte dei casi di MF sembrano mostrare un fenotipo Th2 (Figura 2). E nonostante sia dimostrata, in fase iniziale di malattia, una vigorosa risposta immunologica caratterizzata dalla presenza di cellule T IFN-γsecernenti CD8 + / TIA-1, la produzione cronica di citochine Th2,come IL-4,IL-5,e IL-10 da parte della popolazione T maligna rappresenta probabilmente un meccanismo mediante il quale le cellule tumorali aggirano la risposta immune antitumorale. Anche in stadio avanzato della malattia, la risposta dell ospite,sebbene indebolita, può svolgere un ruolo, seppur piccolo, per il contenimento della progressione della malattia. Questo è stato dimostrato dalla rapida progressione della Sindrome di Sezàry associata con l uso di agenti immunosoppressori come la ciclosporina. 13

8 Oltre a una maggiore produzione di citochine Th2 durante la progressione della malattia, i pazienti con cellule T maligne in circolo manifestano anche difetti nella produzione di citochine Th1. E stato osservato un progressivo declino della produzione di IL-12 e di IFN-α da parte delle cellule del sangue periferico, associato, sempre su sangue periferico, ad un incremento quantitativo di cellule T maligne. Il declino della produzione di queste citochine è direttamente correlato con il declino del numero di elementi granulocitari e monocitari su sangue periferico e cellule plasmocitoidi dendritiche (PDCs) su tessuto. La diminuzione di PDCs e il difetto nella produzione di IL-12 si associa ad un presunto deficit nella produzione di altri prodotti delle cellule dendritiche, come IL-15e IL-18 che sono importanti agenti stimolanti l IFN-γ e potenti attivatori di risposte Th1. Alla base del calo della produzione di citochine Th1 e del numero delle DCs circolanti c è la maggiore produzione delle citochine Th2 che possono compromettere sia la maturazione di DC che la produzione di IL-12/IFN-γ. Altri meccanismi responsabili della ridotta produzione di IL-12 sono stati evidenziati da recenti studi che hanno dimostrato un difetto nell espressione del CD40L su cellule T maligne derivate da pazienti con Sindrome di Sèzary. ll CD40L non è espresso sulle cellule T resting, ma è normalmente sovraregolato sulla superficie delle cellule T stimolate. Al contrario, le cellule T maligne CD4 + non esprimono il CD40L su impegno del TCR con anticorpi anti-cd3. Chiaramente, l'assenza di interazione di CD40L con CD40 sulle APCs nel corso di una risposta immunitaria può portare ad una profonda riduzione 14

9 dell attivazione di DC e della produzione di citochine. Recentemente, è stato dimostrato che, in vitro, cellule T CD4+ maligne derivate da pazienti con linfomi cutanei T, possono essere indotte a esprimere un fenotipo CD25 + Treg. Così, quando le cellule T maligne sono messe in coltura con DCs che hanno avuto l'opportunità di processare un numero significativo di cellule T apoptotiche, esse sovraregolano l espressione di CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antygen 4),esprimono Foxp 3 e sviluppano un elevata capacità di produrre IL-10, e TGF-β. Se davvero che la MF sia è una neoplasia di Tregs, questo può essere una spiegazione supplementare convincente sottesa alla immunosoppressione osservabile in stadio avanzato di malattia. I risultati finali delle alterazioni dell espressione di citochine durante la progressione della MF sono alterazione a molteplici livelli dell immunità cellulare. La progressione dallo stadio precoce allo stadio più avanzato della MF è associata tipicamente ad un marcato declino nel numero e nell attività delle cellule NK. Analogamente, un calo nel numero delle cellule T CD8 + su sangue periferico accompagna un forte incremento di cellule T maligne circolanti. Inoltre, la percentuale di cellule citotossiche che esprimono markers di attivazione, come CD69, è anche significativamente ridotta rispetto ai pazienti con MF senza evidente coinvolgimento del sangue periferico. Una riduzione del funzionamento di cellule NK e di linfociti T CD8 + è quasi sicuramente associata a un deterioramento sia dell immunità antitumorale che della sorveglianza immunitaria contro i 15