V CONGRESSO NAZIONALE SIMCRI TAORMINA OTTOBRE 2018

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1 V CONGRESSO NAZIONALE SIMCRI TAORMINA OTTOBRE 2018 IL CGF NEL TRATTAMENTO DI LESIONI CUTANEE Scopo del documento L utilizzo di concentrati piastrinici è entrano nella pratica quotidiana del trattamento delle lesioni cutanee, suffragato da linee guida (SIMTI 2012 e SIMCRI 2016) e da rewiew della letteratura Cochrane 2016, tuttavia la letteratura scientifica è limitata dalla eterogeneità delle procedure di preparazione e di utilizzo del prodotto o dalla mancanza di informazioni complete sulle procedure adottate. Il CGF è un innovativo preparato piastrinoso caratterizzato dalla standardizzazione della procedura di separazione deli elementi corpuscolati a mezzo di centrifugazione. Scopo del presente documento, nell attesa di un corpus di letteratura adeguatamente vasto e valido per l elaborazione di evidenze scientifiche, è fornire una guida, condivisa ed approvata da vulnologi affiliati alla SIMCRI, sulla preparazione e l utilizzo del CGF nelle lesioni cutanee avendo un duplice indirizzo: 1- fornire ai professionisti che si occupano di ferite cutanee delle istruzioni per l uso che evitino interpretazioni troppo creative della metodica; 2- guidare i ricercatori a fornire nei lavori da pubblicare tutte le informazioni che questa Società Scientifica ritiene necessarie per costruire una letteratura idonea alla acquisizione di evidenze scientifiche nel campo delle applicazioni vulnologiche del CGF. Definizione del CGF Il PRP è ottenuto con procedure ben note ed in uso da molti anni, tanto da essere stato oggetto di linee guida SIMTI nel 2012, di una rewiew Cochrane nel 2016 e di Linee Guida SIMCRI nel La procedura comporta l effettuazione di un prelievo ematico con una normale provetta con anticoagulante, seguito dalla sua introduzione in una centrifuga per ottenere una prima separazione della componente rosssa rispetto a quella nella quale sono presenti le piastrine. Una seconda centrifugazione consente di ottenere una concentrazione di piastrine di almeno 8^6-10^6/mmc. Il concentrato piastrinico può poi essere utilizzato come tale, essere attivato per ottenere il released con gluconato di Ca++, trombina (endogena o esogena) o è possibile ottenere il lised attraverso la frammentazione delle piastrine con congelamento o con ultrasuoni. La notevole eterogeneità ed il numero di manipolazioni necessarie per raggiungere il prodotto finale rendono difficile confrontare il vari prodotti ottenuti, che hanno un carattere sostanzialmente artigianale. Di qui la necessità di disporre di una modalità di preparazione del concentrato piastrinico che fosse standardizzabile e che, pur nella varietà delle caratteristiche del sangue di partenza, consentisse di avere un prodotto finale omogeneo tra i vari operatori a vantaggio della omogeneità di trattamento del paziente e della ricerca.

2 Il CGF è un innovativo preparato piastrinico da sangue periferico autologo che può essere ottenuto in forma solida o liquida, configurandosi come una evoluzione del PRP rispetto al quale differisce prevalentemente per la standardizzazione della procedura di preparazione. Il CGF solido inoltre non richiede alcuna manipolazione nè l aggiunta di alcun componente al sangue del paziente, con conseguente incremento della sicurezza. Nella sua forma solida si presenta di consistenza gelatinosa ed è costituito da uno scaffold di fibrina che ingloba le piastrine e le cellule circolanti ed è capace di rilasciare fattori di crescita. Grazie alla standardizzazione della procedura di produzione si conosce la distribuzione delle componenti corpuscolate del sangue nel coagulo ottenuto (CGF solido) o nelle stratificazioni della provetta (CGF liquido). L utilizzo clinico del CGF è ancora agli inizi, tuttavia sono presenti numerose esperienze in ambito odontoiatrico, ortopedico e chirurgico oltre che vulnologico, anche se la letteratura è ancora molto limitata. E in corso uno Studio Clinico Multicentrico Controllato Randomizzato sulla applicazione del CGF nel trattamento delle ferite difficili distali e del piede, i cui risultati preliminari sono già in parte stati presentati nel 2017 Florio. Modalità di effettuazione del prelievo: Si utilizza un normale sistema di prelievo con la vena evidenziata mediante apposizione di un laccio a monte che va rimosso all inizio della raccolta per ridurre al minimo la stasi e la possibile preattivazione degli elementi corpuscolati del sangue (piastrine, leucociti). Per il CGF solido si utilizzano provette in vetro a fondo tondo da 10 ml completamente prive di qualsiasi sostanza esogena (tappo rosso), mentre per il CGF liquido si utilizzano provette con anticoagulante (tappo verde). Si raccomanda l utilizzo del citrato come anticoagulante. Un recente studio ha dimostrato che la natura della provetta può condizionare il risultato finale, infatti l utilizzo di una provetta in vetro, soprattutto se con fondo conico comporta la formazione di un CGF più voluminoso e con una minore compattezza della distribuzione delle cellule nel buffy coat rispetto alla provetta di plastica (PET), rivestita di silice ed a fondo tondo utilizzata per le prime esperienze di produzione del CGF (Bonazza 2016). Procedura di centrifugazione Per la preparazione del PRP è possibile utilizzare una qualsiasi centrifuga, per cui non esiste una predeterminata accelerazione/velocità di rotazione, ma questa viene scelta sulla base della geometria della centrifuga, dell esperienza e dei consigli del costruttore, inoltre alla prima centrifugazione in genere ne segue una seconda per raggiungere una concentrazione piastrinica di 10 6 piastrine /mm 3. Nel caso del CGF il dispositivo è già programmato per attuare, a temperatura ambiente, una sequenza di rotazioni a diverse velocità in sequenza e senza passare per fasi di arresto che ha nel complesso una durata di circa 15. Tale sequenza è stabilita dal costruttore e non è modificabile dall utente.

3 Il programma di centrifugazione è il medesimo sia per il CGF solido che liquido. Si consiglia di effettuare la centrifugazione quanto prima e comunque entro 15 dal prelievo, nell attesa la provetta va tenuta a temperatura ambiente. Un recente studio dimostra che congelando a -80 C il sangue prelevato in provetta addizionata di anticoagulante, il CGF ottenuto 2 giorni dopo il prelievo conserva le caratteristiche osservate nel CGF da sangue fresco (Isobe 2017). Si ricorda che la normativa italiana impedisce la conservazione del sangue in strutture diverse dai centri trasfusionali. Una volta preparato anche il CGF deve essere utilizzato immediatamente. Composizione del CGF Al termine della centrifugazione sia nel CGF solido che in quello liquido otterremo macroscopicamente una stratificazione in tre livelli: strato superiore corrispondente al plasma povero di piastrine (PPP), uno strato intermedio corrispondente al CGF ed uno strato inferiore corrispondente agli eritrociti, questi ultimi separati dal sottile buffy coat. Studi citologici hanno consentito l identificazione delle componenti figurate del sangue nei vari strati Rodella, Borsani, Bonazza 2016: livello macroscopico Parte liquida composizione siero plasma povero di piastrine (PPP) Coagulo CGF bianco CGF con cellule CD34 + buffy coat leucociti (comprese cellule CD34 + ) eritrociti con cellule CD34 + CGF rosso eritrociti Il CGF è composto da una rete di fibrina più compatta al confine con la parte rossa, imbibito di plasma e nel quale sono inglobate le piastrine che a loro volta sono più concentrate verso l interfaccia con la zona rossa Borsani, soprattutto se si utilizzano provette in plastica Bonazza Si ritiene che il numero di piastrine integre presenti nel CGF sia circa la metà di quelle presenti del prelievo a causa della loro parziale distruzione nel corso della procedura, determinando il rilascio immediato di fattori di crescita Borsani, mentre quelle integre sarebbero la fonte del rilascio protratto Borsani.

4 Le cellule nucleate si concentrano soprattutto nel buffy coat Rodella, Bonazza 2016, zona bianco/camoscio chiaro di confine tra il CGF e la zona rossa, ma sono presenti in modo più sparso anche nella zona rossa. Pur essendoci opinioni divergenti sull utilizzo in ambiti non vulnologici (ortopedia, odontoiatria, ecc.), si ritiene che queste cellule siano utili nel processo di guarigione di ferite cutanee, in quanto si tratta prevalentemente di fagociti professionali (granulociti polimorfonucleati, monociti), effettori dell immunità naturale, e sarebbero implicati anche nella produzione di un quota del VEGF rilasciato. Con analoga distribuzione, ma notevolmente più rare, troviamo le cellule CD 34 + Rodella, precursori mesenchimali di derivazione midollare implicati anche nei processi di neoangiogenesi. Studi condotti sul PRP hanno dimostrato che vi è una significativa variabilità interindividuale nel rilascio di fattori di crescita da parte dei concentrati piastrinici, probabilmente per una diversa entità dei depositi nei granuli alfa Weilbrigh2002 I fattori di crescita sono prevalentemente depositati nei granuli alfa delle piastrine e sono liberati in parte immediatamente nel corso della procedura, in parte nei giorni successivi in quanto rilasciati dalle piastrine ancora integre inglobate nel CGF e probabilmente anche da componenti cellulari. Le cinetiche del rilascio sono diverse per i vari fattori di crescita, probabilmente in relazione sia alla diversa entità dei loro depositi nei granuli piastrinici sia alla loro neosintesi a partire dall RNA piastrinico, quest ultima è stata dimostrata anche giorni dopo la preparazione del CGF Senzel Il rilascio di fattori di crescita sembra quindi obbedire ad una fine regolazione finalizzata ad ottimizzare il processo di guarigione. In sintesi il CGF è una combinazione di scaffold di fibrina che ingloba le piastrine con i relativi prodotti e la componente leucocitaria che probabilmente ha un ruolo non trascurabile, il tutto in assenza di problemi etici (sangue autologo) e con elevata sicurezza (utilizzo estemporaneo, procedura standardizzata e senza manipolazioni). Utilizzo del CGF nelle ulcere/ferite cutanee CGF solido Estraendo con una pinzetta il coagulo presente nella provetta o versando il contenuto su un apposita griglia, il coagulo si presenterà di consistenza solida-gelatinosa e bicolore: una porzione giallastra corrispondente al CGF ed una porzione rossa, corrispondente al coagulo rosso, la cui porzione confinante con il coagulo bianco contiene anche parte delle cellule CD34 + Borsani, separati dal sottile buffy coat. Volendo recuperare anche la quota cellulare CD34 + il coagulo va tagliato con delle forbici sterili a circa 2,5 mm dal confine con il coagulo bianco. La restante parte rossa, costituita prevalentemente da globuli rossi e fibrina, non ha attualmente alcun utilizzo clinico.

5 Il CGF può essere applicato direttamente sulla lesione, anche in caso di ferite profonde o cavitarie sfruttando la volumetria del materiale. Il numero di unità di CGF dipenderà pertanto dalla superficie e dal volume della lesione. E possibile trasformare il CGF in una membrana bioattiva schiacciandolo tra due garze o con un apposito schiaccino sterile. Si ottiene così una membrana resistente e suturabile. E stato dimostrato che anche in questa forma il CGF continua a rilasciare fattori di crescita per circa una settimana. Il CGF in forma di membrana può essere utilizzato per ferite più superficiali e può essere suturato. Occorre completare la medicazione con l applicazione di una garza grassa, che a sua volta sarà ricoperta da garza sterile opportunamente fissata. La maggior parte delle esperienze attuali è stata condotta utilizzando questa procedura, che consente un adeguato controllo dell umidità fino ad una settimana. Il cambio di medicazione deve avvenire dopo 1 settimana, tempo nel corso del quale è stato dimostrato il costante rilascio di fattori di crescita Borsani. Al cambio di medicazione si potrà optare per l applicazione di una medicazione avanzata, scelta sulla base dei principi della wound bed preparation, oppure si potrà riapplicare il CGF. Nella pubblicazione di lavori scientifici si raccomanda di precisare i seguenti punti: dimensioni (possibilmente utilizzando supporti informatici, p.es. MOWA), stato e caratteristiche della ferita al momento dell applicazione del CGF (presenza microbica, di slough, ecc.), tipo di provetta utilizzato, utilizzo del CGF tal quale o in forma di membrana (specificando se suturata o no), numero di unità utilizzate, materiale utilizzato per la medicazione secondaria, applicazione eventuale di bendaggio compressivo, tempo trascorso per il cambio medicazione, prosieguo delle medicazioni con advanced dressings o con nuova applicazione di CGF. Tra gli outcome dello studio oltre al tempo di guarigione o numero di lesioni guarite dopo un tempo determinato e la riduzione della superficie della lesione dovranno essere indicate la qualità della cicatrice (specificando i criteri di valutazione adottati) e le variazioni del dolore e della qualità della vita utilizzando scale validate. CGF liquido Nella provetta si presentano stratificate le componenti figurate in maniera analoga al CGF solido sopra descritto. Si procede cautamente al prelievo del CGF dalla provetta con una siringa avendo cura di consentire l ingresso dell aria nella provetta per evitare turbolenze. L ago viene portato al confine tra la parte bianca e quella rossa e lentamente si aspira il contenuto per un totale di circa 7 ml lasciando sul fondo la componente rossa e il sopranatante il plasma povero di piastrine. Volendo recuperare una quota ulteriore delle cellule CD34+ si possono aspirare anche i 2 ml più superficiali della porzione rossa. Il prodotto così ottenuto può essere iniettato in sede periulcerosa. L iniezione può essere dolorosa, per cui va presa in considerazione l applicazione di una anestesia locale, anche basata su creme anestetiche. Si ritiene che la componente leucocitaria possa essere responsabile della dolorosità dell iniezione. Le esperienze con l utilizzo del CGF liquido sono poco numerose, ma, per analogia con le cinetiche di rilascio del CGF solido, si ritiene necessario attendere almeno una settimana prima di una successiva applicazione.

6 Nella pubblicazione di lavori scientifici con CGF liquido si raccomanda di precisare i seguenti punti: dimensioni (possibilmente utilizzando supporti informatici, p.es. MOWA), stato e caratteristiche della ferita al momento dell applicazione del CGF (presenza microbica, di slough, ecc.), tipo di provetta utilizzato, sede delle iniezioni, volumi utilizzati, materiale utilizzato per la medicazione della lesione, applicazione eventuale di bendaggio compressivo, tempo trascorso per il cambio medicazione, tempo di eventuale nuova applicazione di CGF. Anche in questo caso tra gli outcome dello studio oltre al tempo di guarigione o numero di lesioni guarite dopo un tempo determinato e la riduzione della superficie della lesione dovranno essere indicate la qualità della cicatrice (specificando i criteri di valutazione adottati) e le variazioni del dolore e della qualità della vita utilizzando scale validate. Bibliografia Borsani E., Bonazza V., Buffoli B, Cocchi M.A, Castrezzati S., Scarì G., Baldi F., Pandini S., Licenziati S., Parolini S., Rezzani R., Rodella L.F. Biological Characterization and In Vitro Effects of Human Concentrated Growth Factor Preparation: An Innovative Approach to Tissue Regeneration. Biology and Medicine 2015, 7 (5). Isobe K et al Platelet-rich fibrin prepared from stored whole-blood samples International Journal of Implant Dentistry (2017) 3:6 Bonazza V, Borsani E, Buffoli B, Castrezzati S, Rezzani R, Rodella LF. How the different material and shape of the blood collection tube influences the Concentrated Growth Factors production. Microsc Res Tech Dec;79(12): Rodella, LF, et al. Growth factors, CD34 positive cells, and fibrin network analysis in concentrated growth factors fraction. Microscopy research and technique 74.8 (2011): Senzel L, Gnatenko DV, Bahou WF. The platelet proteome. Curr Opin Hematol Sep;16(5): Weibrich G, Kleis WK, Hafner G, Hitzler WE. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg Apr;30(2): Cochrane Database: Martinez-Zapata MJ, Martí-Carvajal AJ, Solà I, Expósito JA, Bolíbar I, Rodríguez L, Garcia J. Autologous platelet-rich plasma for treating chronic wounds. Cochrane Database Syst Rev Oct 17;10:CD Linee Guida SIMCRI2016 Linee Guida SIMTI2012 Florio A, M.A. Farina, B. Amato, M. Sallustro And Cgf Working Group. Concentrated Growth Factors (CGF) versus terapia convenzionale per il trattamento delle ulcere venose degli arti inferiori: risultati preliminari di uno studio prospettico multicentrico Atti Congresso Congiunto V Congressso di Chirurgia Vascolare e IV Congreso Nazionale SIMCRI Sorrento 30/11-02/12/2017.