UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PAVIA FACOLTA DI SCIENZE MM. FF. NN. FARMACIA E MEDICINA

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PAVIA FACOLTA DI SCIENZE MM. FF. NN. FARMACIA E MEDICINA DIPARTIMENTO DI FISICA NUCLEARE E TEORICA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE CORSO DI LAUREA INTERFACOLTA' IN BIOTECNOLOGIE INDUSTRIALI STUDI PRELIMINARI PER L APPLICAZIONE DELLA BORON NEUTRON CAPTURE THERAPY (BNCT) ALLE METASTASI DIFFUSE NEL POLMONE DI RATTO Relatore: Chiar.mo Prof. Saverio Altieri Correlatori: Chiar.ma Prof.ssa Rosanna Nano Dott. James G. Bakeine Tesi di Laurea Magistrale di Marta Di Salvo Anno Accademico

2 INDICE Introduzione 3 Capitolo 1 7 La terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT) Le basi della BNCT La BNCT delle metastasi epatiche diffuse Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico Il follow up post operatorio Discussione e conclusioni 19 Capitolo 2 21 La BNCT nel trattamento dei tumori polmonari diffusi Cancro polmonare: stato attuale della ricerca Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale La BNCT nei tumori diffusi del polmone Il modello animale Misura della concentrazione di 10 B nel polmone di ratto Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello.. 35 Capitolo 3 37 Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di ratto Trattamento BNCT in vitro Efficienza di piastramento Sopravvivenza delle cellule post-irraggiate Studio in vivo Caratterizzazione istologica della malattia polmonare metastatica 45 Capitolo 4 49 Conclusioni e sviluppi futuri 49 Bibliografia 52 1

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4 Introduzione Una terapia ideale per il trattamento dei tumori diffusi deve distruggere selettivamente tutte le cellule tumorali senza creare danni al tessuto normale; la terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT) è un trattamento bimodale che presenta caratteristiche che si avvicinano a questo ideale; essa è basata sull'effetto biologico indotto nei tessuti dalla reazione nucleare 10 B(n,α) 7 Li e la sua selettività dipende non solo dal campo neutronico con cui si irraggia il tumore ma anche e soprattutto dalla diversa biodistribuzione dell'elemento 10 B nelle cellule tumorali rispetto a quelle sane. Sfruttando il differente metabolismo tra cellule tumorali e sane, l'accumulo del boro produce una distinzione significativa tra le unità tissutali e dunque, in seguito all'irraggiamento, un trattamento differenziato dei tessuti malati rispetto a quelli normali [1,2]. Questa proprietà intrinseca del trattamento acquista un particolare valore nei quadri clinici dei tumori multifocali distribuiti sull'intero volume dell'organo e che, quindi, non sono trattabili con le consuete tecniche radioterapiche. La presente tesi si inserisce nello studio condotto (presso l'università di Pavia con finanziamenti MIUR e INFN) sulla fattibilità della BNCT dei tumori diffusi, in particolare quelli polmonari; il carcinoma polmonare, infatti, tra tutte le patologie oncologiche, presenta l'incidenza più alta a 3

5 livello mondiale e ha, d'altro canto, la peggior prognosi. Inoltre, le metastasi che interessano il polmone sono quasi sempre letali perchè sono in forma diffusa e chirurgicamente non operabili. La BNCT mostra una serie di caratteristiche intrinseche che la rendono una terapia potenzialmente radicale per questo tipo di patologie. La ricerca condotta a Pavia in ambito BNCT ha riguardato il trattamento dei tumori diffusi inoperabili; in passato il gruppo si è dedcato al trattamento delle metastasi epatiche diffuse e più recentemente è passato studiare la possibilità di estendere l applicabilità della BNCT ai tumori polmonari diffusi. Come primo step in quest ultimo campo è stata affrontata la verifica dell assorbimento selettivo del boro nel tumore e la possibilità di creare un campo di neutroni termici uniforme nel volume polmonare da irraggiare. Da un lato è stato messo a punto un modello di ratto con metastasi polmonari da adenocarcinoma del colon ed è stato studiato l assorbimento del boro in funzione del tempo, sia nei tessuti tumorali sia nel polmone sano; dall altro è stata studiata con metodi di Monte Carlo la distribuzione della dose di radiazione nel torace di un modello antropomorfo. Nel lavoro sull assorbimento del boro e sulla sua biodistribuzione nel ratto con metastasi polmonari, è stato dimostrato che si produce una concentrazione di boro 4-5 volte più alta nel tumore rispetto al parenchima polmonare sano dopo 4 ore dall iniezione intraperitoneale di Borophenilalanina (BPA) [3,4]. 4

6 Con calcoli Molte Carlo si è visto che irraggiando un modello di torace umano con due fasci collimati e contrapposti (antero-posteriore e posteroanteriore) di neutroni epitermici [5,6] si ottiene in tutto il polmone una distribuzione uniforme di neutroni termici; questo garantisce la possibilità di colpire il tumore con la stessa efficacia indipendentemente dalla sua posizione nell organo. Questi risultati positivi ci hanno spinti a proseguire nella ricerca, che è stata indirizzata allo studio dell efficacia del trattamento delle metastasi nell animale per mezzo della linea cellulare DHD/K12/TRb di adenocarcinoma del ratto. Si sta studiando la sopravvivenza di queste cellule trattate con Borophenilalanina (BPA) e irraggiate con neutroni; lo studio viene condotto sia in vitro sia nell animale. La tappa finale di questa ricerca prevede l irraggiamento nella colonna termica del reattore TRIGA Mark II dell Università di Pavia, di un certo numero di ratti con tumore e trattati con BPA. Da questo punto di vista l esperimento rappresenta la prosecuzione degli studi condotti al MIT (Massachussets Institute of Technology) di Boston dedicati allo studio degli effetti della BNCT nel polmone sano di ratto. Il lavoro descritto in questa tesi riguarda lo studio dell efficacia della BNCT nel tumore metastatico polmonare; sono stati condotti esperimenti sia in vitro che in vivo-vitro. Cellule di adenocarcinoma del colon DHD/K12/TRb, in grado di produrre metastasi polmonari nel ratto, sono 5

7 state trattate con BNCT ed inoculate in ratti singenici BD-IX; è stata quindi studiata l efficacia del trattamento BNCT valutando la sopravvivenza dei ratti e analizzando nell animale la capacità proliferativa delle cellule trattate. 6

8 CAPITOLO 1 La terapia per cattura neutronica sul Boro (BNCT) 1.1 Le basi della BNCT La BNCT (Boron Neutron Capture Therapy) è una terapia oncologica basata sull'irraggiamento con neutroni di bassa energia di un volume tumorale dopo la somministrazione di un drogante borato in grado di accumularsi selettivamente nelle cellule malate. L'isotopo 10 del boro non è radioattivo e presenta una sezione d'urto estremamente elevata (3837 barn) per la cattura di neutroni termici mediante la reazione 10 B(n,α) 7 Li (fig.1). Fig. 1 Rappresentazione schematica della reazione di cattura neutronica sul 10 B. In seguito a questa reazione nucleare vengono emesse particelle α e ioni Li ad alto Trasferimento Lineare di Energia (LET) e con range in tessuto di 7 e 7

9 4 µm, rispettivamente, confrontabili con le dimensioni lineari delle cellule; queste particelle trasportano un energia complessiva di 2.79 MeV che viene rilasciata entro pochi µm dal punto di produzione. Il razionale alla base della BNCT come terapia medica sta dunque nella possibilità di depositare, mediante la radiazione prodotta dall'irraggiamento del 10 B, una dose sufficientemente alta da indurre delle lesioni letali, quali danni irreversibili al DNA e apoptosi, nella cellula tumorale che ha accumulato il drogante. Le particelle pesanti sono più efficaci delle radiazioni γ o degli elettroni nel produrre danni biologici. Infatti gli effetti dell irraggiamento di un tumore sono legati non solo alla dose assorbita, che esprime a livello macroscopico l energia assorbita per unità di massa, ma anche ad almeno altri 2 parametri: 1) il modo di trasferire energia dalla radiazione al tessuto, espresso dal LET, che rappresenta la densità lineare di energia ceduta lungo il percorso della particella (si misura in KeV/ μm); 2) il contenuto di ossigeno nei tessuti irradiati; gli effetti biologici solitamente diminuiscono quando si riduce il contenuto di ossigeno nei tessuti e di questo bisogna tener conto quando si irraggiano tessuti tumorali, nei quali il tenore di ossigeno è generalmente basso, poiché sono scarsamente vascolarizzati. 8

10 Sperimentalmente si è osservato che le radiazioni ad alto LET come particelle α e ioni pesanti, nel danneggiare le cellule, sono più efficaci delle radiazioni a basso LET (elettroni, X, γ) e il loro effetto non risente della scarsa ossigenazione. Questo fatto si può spiegare perché nel caso di radiazioni ad alto LET gli effetti di danno sono legati alle elevate cessioni locali di energia, che comportano più frequenti rotture del DNA delle cellule colpite. E ovvio che la BNCT, in cui entrano in gioco particelle α e 7 Li sia più efficace delle terapie con elettroni o raggi γ. I danni biologici, essendo legati alla dose, dipendono dal numero di reazioni 10 B (n,α) 7 Li che avvengono nella cellula e quindi dalla concentrazione di 10 B e dall intensità del fascio di neutroni termici. Poiché si vuole dare una dose letale di radiazione solo alle cellule tumorali, risparmiando quelle sane, è necessario che la concentrazione di 10 B nei tessuti tumorali sia maggiore che nei sani. A tale scopo è importante la ricerca di composti veicolanti il Boro, che entrino in modo preferenziale nelle cellule tumorali, permettendo di raggiungere un rapporto tra la concentrazione di 10 B in tessuti tumorali e sani significativi per la terapia. Se il veicolante del 10 B fosse assorbito esclusivamente dalle cellule tumorali si disporrebbe di una terapia totalmente selettiva, in grado cioè di danneggiare solo il tessuto malato risparmiando completamente il 9

11 circostante sano (purchè una raggiunta una concentrazione minima di soglia). Nella pratica questo purtroppo non avviene ed è dunque importante raggiungere nei tessuti delle condizioni di deposito differenziale, che ovviamente privilegino la componente istologica tumorale. Si osservi inoltre che, data l'anatomia di un tumore, l'irraggiamento neutronico non potrà mai interessare esclusivamente i volumi tumorali ma inevitabilmente interesserà anche regioni istologicamente sane. Nella pratica medica della BNCT si raggiunge quindi la selettività richiesta somministrando al tumore una dose letale mantenendo la dose ai tessuti sani al di sotto di un valore di tolleranza tipico di ogni tessuto. L indiscusso vantaggio della BNCT è la selettività che non trova significativi rivali nelle altre tecniche radioterapiche, comprese quelle all avanguardia come l adroterapia. Nella BNCT la selettività non dipende dal campo di irraggiamento ma a dalla biodistribuzione del 10 B, che, come è stato dimostrato, può essere accumulato preferenziale nelle cellule tumorali quando veicolato da appositi farmaci. Ancora, visto che l'accumulo di 10 B interessa indipendentemente ogni singola cellula, con la BNCT si possono trattare anche foci tumorali così piccoli da risultare invisibili alle normali indagini diagnostiche, fornendo così anche ai pazienti in stadi estremamente avanzati e con metastatizzazione capillare diffusa una speranza di cura e sopravvivenza. 10

12 L'impiego della BNCT alla gamma più vasta possibile di patologie neoplastiche dipende criticamente dai progressi riportati nei vari campi di ricerca coinvolti, quali la fisica biomedica, la chirurgia e la radioterapia. A monte è comunque imprescindibile la sintesi di nuovi droganti, in grado di assicurare rapporti di concentrazione tumore/sano per il 10 B anche più elevati di quelli attualmente ottenibili. I droganti attualmente impiegati per la BNCT clinica sono il BSH (Sodium Dodecaborane (Na 2 B 12 H 11 SH) e il BPA (BoroPhenylAlanine, C 9 H BNO 4 ). Il primo risulta particolarmente adatto al trattamento dei tumori cerebrali. Infatti, la cinetica di accumulo della molecola prevede l'attraversamento della barriera emato-encefalica solo nelle zone in cui la struttura è danneggiata dal tumore. Il meccanismo è passivo e perciò non garantisce dei rapporti di concentrazione tra il tumore e il sangue superiori a 2; inoltre il boro si va a depositare nello spazio intracellulare, rimanendo relativamente lontano dal nucleo più radiosensibile. Al contrario, la BPA entra nelle cellule mediante un meccanismo attivo e si distribuisce nel nucleo cellulare e nel citoplasma in modo uniforme. Il meccanismo attivo assicura un considerevole interessamento del sangue, che comunque presenta valori di concentrazione tra la metà e un quarto di quella caratteristica del tumore, garantendo così una buona selettività. 11

13 Gli studi attualmente in corso hanno come principio cardine lo sviluppo di molecole in grado di rispondere specificatamente ad agenti espressi dalle cellule tumorali, così da disporre di droganti dedicati alle singole linee cellulari. La più interessante eccezione a questo approccio è rappresentata dalla molecola GB-10 che esplica la sua selettività non tanto nel deposito cellulare quanto in uno specifico effetto a carico dei vasi sanguigni propri della massa tumorale [7]. Le altre possibili frontiere della ricerca in campo chimico sono le nanotecnologie e l'impiego dei liposomi. Con le prime si tenta di costruire una nanostruttura cava all'interno della quale depositare il boro. La selettività potrebbe essere assicurata mediante l'impianto sulla superficie della nanoparticella di recettori specifici per il tumore di volta in volta trattato [8]. Un meccanismo analogo impiegherebbe i liposomi, che hanno dimostrato capacità di trasporto del boro sia in esperimenti in vitro che in vivo [9]. 1.2 La BNCT delle metastasi epatiche diffuse In questo paragrafo viene illustrata l applicazione della BNCT al trattamento delle metastasi diffuse e multifocali insediate in organi che possono essere sottoposti alla procedura di autotrapianto; il protocollo 12

14 originale messo a punto a Pavia è noto con l'acronimo TAOrMINA (Trattamento Avanzato di Organi Mediante Irraggiamento Neutronico ed Autotrapianto) ed è stato applicato per la prima volta al mondo su due pazienti terminali [10,11]. Nel 1984 presso l Università di Pavia fu avviato un grande programma multidisciplinare di ricerca con l obbiettivo di applicare la BNCT al trattamento delle metastasi epatiche diffuse e non operabili chirurgicamente. Le fasi principali del trattamento prevedono la perfusione del fegato con BPA, l espianto dell orgnao, l irraggiamento all interno di una postazione del reattore nucleare e il successivo reimpianto nel paziente. Il programma è stato sviluppato da una collaborazione fra la sezione pavese dell Istituto Nazionale di Fisica Nucleare (INFN), il Dipartimento di Fisica Nucleare e Teorica e i Dipartimenti di Chirurgia e di Biologia Animale. L applicazione sui pazienti è stata preceduta da una lunga fase di studio in vitro ed in vivo su un modello animale messo a punto dalla collaborazione. Cellule neoplastiche della livnea DHD/K12/TRb da adenocarcinoma sono state iniettate per via intrasplenica in ratti BD-IX inducendo così lo sviluppo di metastasi epatiche. Con questo modello animale è stata dapprina dimostrato l assorbimento selettivo del boro nelle metastasi epatiche; come carrier del boro è stata usata la 10 BPA, una sostanza che penetra nelle cellule 13

15 cancerogene con un meccanismo di trasporto attivo, cosicchè la concentrazione di 10 B nelle cellule può essere più alta di quella presente nel fluido interstiziale e nel mezzo di coltura [12-13]. Gli effetti della BNCT sono stati studiati in vitro sulla suddetta linea cellulare. Dopo la crescita in terreno di cultura contenente BPA le cellule sono state sottoposte ad irraggiamento neutronico. Gli effetti in vitro sono stati studiati sulle cellule seguendo la loro capacità proliferativa con il test dell efficienza di piastramento, una delle più comuni procedure per valutare la sopravvivenza delle cellule dopo l irraggiamento. La valutazione della sopravvivenza dipende dalla dimostrazione che le cellule mantengono la capacità proliferativa per formare colonie contenenti più di 50 cellule [14]. Gli esperimenti sono stati fatti su cellule mantenute per 18 ore in un medium contenente 10 BPA in quantità tali da produrre una concentrazione di 20 ppm di 10 B. Dopo l irraggiamento neutronico (ad una fluenza di neutroni termici di 7x10 12 cm-2) le cellule sono state seminate in varie flasks di coltura e su piastre Petri per l osservazione a diversi intervalli di tempo: 1, 2, 5, 7, 9, 12, 15 e 21 giorni e per effettuare il conteggio delle cellule e l analisi del DNA; naturalmente nello studio sono stati osservati campioni di controllo (varie combinazioni fra esposizione al boro e all irraggiamento neutronico). Il test dell efficienza di piastramento è stato fatto seminando cellule in 5 piastre Petri replicate per ciascuna concentrazione selezionata con un range che va da 50 a 250 cellule per i campioni di controllo e da 1x10 5 a 5x10 5 per la 14

16 cellule trattate. Le cellule sopravvissute dopo il trattamento sono visibilmente allungate, fenomeno dovuto a una mancata divisione cellulare e quindi ad un aumento del contenuto di DNA. L efficienza di piastramento conferma gli effetti del trattamento ma evidenzia anche la presenza di una subpopolazione di cellule resistenti pari a circa lo 0.05% delle cellule trattate. Il test di validazione preclinico in vivo è consistito nello svolgimento dell intera procedura della BNCT nel ratto con metastasi epatiche di colon carcinoma. Risultati ottenuti [15-16] hanno dimostrato: 1) che il tessuto epatico sano non è stato danneggiato dal trattamento BNCT; 2) la presenza di cellule fagocitarie di Kupffer; 3) la presenza di leucociti coinvolti nel processo di rimozione dei debris cellulari Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico Nel 2001, avendo ottenuto l approvazione del Comtato Etico del Policlinico S. Matteo e del Ministero della Salute, è stato dato l avvio al programma dell applicazione clinica della BNCT su un fegato isolato[17]. La procedura, applicata su 2 pazienti, comprendeva sostanzialmente tre fasi: la prima fase 15

17 chirurgica includeva la perfusione del fegato con una soluzione di 10 BPA; nella fase radioterapeutica il fegato isolato veniva lavato e raffreddato, trasferito nella colonna termica del reattore nucleare Triga Mark II e irraggiato con una fluenza neutronica di 4x10 12 cm -2 corrispondente ad un tempo di irraggiamento di circa 10 minuti; in seguito, nella seconda fase chirurgica, il fegato veniva reimpiantato nel paziente. Ai controlli successivi all'operazione, il fegato del primo paziente mostrava chiari segni di necrosi nelle zone che in diagnosi erano state classificate come sedi metastatiche, anche laddove le metastasi erano state rilevate solo con un ecografia intra-operatoria (alcune metastasi erano troppo piccole per essere individuate con le attuali tecniche di imaging dall esterno del corpo). Questo primo paziente è sopravvissuto per 4 anni senza mostrare segni di recidive che sono poi purtroppo sopraggiunte sia in sede epatica che extraepatica, portandolo alla morte un anno dopo la loro individuazione. Il secondo caso, trattato nel 2003, ha presentato un decorso peggiore in quanto il paziente è deceduto dopo un mese in seguito ad una trombosi dell'arteria epatica. In questo caso le condizioni iniziali del paziente erano davvero pesantemente debilitate ed era nota una cardiomiopatia che poteva gravemente influenzare l'esito del trattamento. L'analisi postmortem del fegato ha comunque confermato il potenziale curativo della tecnica 16

18 TAOrMINA, mostrando zone necrotiche in corrispondenza di tutte le metastasi: sia quelle accertate dall esterno che quelle accertate nell esame intraoperatorio. Considerando la concentrazione di 10 B nel tumore e nel tessuto normale e quindi le dosi delle radiazioni assorbite, i quadri di questo paziente sono buoni come lo sono stati per il primo; la durata della procedura si è rilevata più breve nonostante le difficoltà insorte dalla correzione chirurgica della suddetta anomalia vascolare Il follow up post operatorio All inizio il periodo post operatorio (cioè le prime tre settimane dopo la BNCT) è stato molto simile in entrambi i pazienti che hanno mostrato sintomi di insufficienza renale ed epatica e una precoce rabdomiolisi con profonda astenia, inibizione dei tessuti maggiori e segni di indebolimento celebrale. Queste manifestazioni cliniche sono apparse secondo una sequenza definita e hanno mostrato una evoluzione simile, apparentemente riconducibile a una sindrome. Possiamo attribuire ciò ad un grande aumento dei mediatori tumorali, probabilmente citochine, prodotte come conseguenza di una grande quantità di lisi cellulare. Dopo la BNCT in questi noduli neoplastici si è osservata la presenza di aree necrotiche di tessuto. Delle piccole aree di danno necrotico sono apparse nel fegato anche 17

19 quando nel periodo pre-operativo non erano state trovate metastasi. Questo lascia supporre che sono state trattate anche neoplasie nascoste diffuse. Il secondo paziente una volta operato ha mostrato delle complicazioni Fig 2.: Aspetto macroscopico del fegato all autopsia del secondo paziente 33 giorni dopo il trattamento. A sinistra, vista esterna della convessità e, a destra, sezione coronarica lungo il lobo destro. Aree necrotiche biancastre multiple sono diffuse sulla superficie parenchimale e all interno dell organo. vascolari che consistevano in una trombosi dell arteria epatica, un insufficienza cardiaca con uno squilibrio liquido ed edema polmonare. Mascroscopicamente sulla superficie del fegato sono state trovate masse biancastre di varie forme e dimensioni. (Figg 2) La corrispondente microscopia ha evidenziato masse necrotiche di tipo coagulativo con scomparsa dell originale struttura istologica (Fig 3). Nella cicatrice diaframmatica aderente al fegato sono state trovate infiltrazioni focali di cellule di carcinoma del colon. Il normale tessuto epatico è stato sottoposto a biopsia e non è stata trovata alcuna metastasi intraepatica. 18

20 Fig 3.: Sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina osservate in campioni ottenuti dal secondo paziente Discussione e conclusioni Le considerazioni finali sono basate sui risultati ottenuti con le applicazioni di una procedura interamente nuova con solo due pazienti..si sono trovati degli aspetti molto positivi in termini di efficienza oncologica. Altri aspetti si sono rilevati meno favorevoli, discutibili e che richiedono miglioramenti. Iniziando dagli aspetti positivi l esperienza clinica conferma l efficacia della BNCT nel distruggere le popolazioni di cellule tumorali e l alta selettività di questo annientamento. Nessun altro tipo di terapia antineoplastica può essere equiparabile. Questa dichiarazione è basata sui risultati dell indagine macroscopica e sulla valutazione microscopica del 19

21 fegato nel secondo paziente. La presenza delle cellule neoplastiche multifocali nei noduli irraggiati testimonia un processo che permette la graduale eliminazione delle popolazioni cellulari, in cui è rallentata la capacità proliferativa dovuta al danno di radiazioni. La locazione di queste cellule alla periferia delle masse necrotiche neoplastiche può essere facilmente espiantata. L attivo ruolo dei fagociti in seguito all irraggiamento con BNCT aumentano e si osservano numerose cellule di Kupffer nell atto di fagocitare detriti cellulari. Anche in termini di tempo di sopravvivenza si sono riscontrati dati eccezionali poichè si sono ottenuti 44 mesi di buona qualità di vita nel primo paziente, se messo a confronto con il tempo medio di sopravvivenza di 4-10 mesi previsti dalla letteratura medica [18,19]. Un altra affermazione che si è riscontrata è la prova del basso impatto della radiazione neutronica sul tessuto normale epatico. Nonostante le diffuse fibrosi epatiche che si sono riscontrate in entrambi i pazienti, la funzione epatica, come valutato dal GEC, è migliorata nel primo paziente dopo la BNCT (73% vs 63% pre-operazione). I disordini clinici e biochimici osservati durante le tre settimane del periodo pre-operativo sono un espressione di una sindrome post-irraggiamento, che può essere mediata dal rilascio di una grande quantità di citochine. 20

22 CAPITOLO 2 La BNCT e il trattamento dei tumori polmonari diffusi I risultati positivi ottenuti nel trattamento mediante BNCT delle metastasi epatiche diffuse ci hanno spinti a studiare la possibilità di estendere questa tecnica al trattamento dei tumori diffusi del polmone. In questo caso abbiamo esplorato anche la possibilità di effettuare il trattamento irraggiando il torace con fasci esterni di neutroni, ossia senza fare ricorse all espianto degli organi. 2.1 Cancro polmonare: stato attuale della ricerca Ogni anno, in tutto il mondo, il cancro viene diagnosticato a circa 10.9 milioni di persone e, nello stesso lasso di tempo, si stimano 6.7 milioni di decessi per cause oncologiche. Ciò significa che circa il 12% dei decessi di qualsiasi natura ha come causa una forma di cancro. Questa frazione varia tra le diverse regioni del globo: si ha un minimo del 4% in Africa ed un massimo del 23% nel Nord America, mentre l'europa si caratterizza con un 19% di frequenza. 21

23 A livello mondiale e prescindendo dalla distinzione tra i sessi, gli studi epidemiologici attuali danno come carcinoma maligno più comune quello polmonare, con circa 1.4 milioni di nuovi pazienti ogni anno, equivalenti al 12.8% di tutti i nuovi casi diagnosticati (Fig. 4). Il 58%dei casi di questo tumore compete ai paesi economicamente più sviluppati [20]. Statistiche molto recenti, risalenti al 2006 e riferite alla sola area europea, danno invece come più frequente il carcinoma alla mammella (13.5% di tutti i casi diagnosticati), seguito da quello al colon retto (12.9%) e, infine, da quello polmonare (12.1%) [21]. Fig. 4: tumori più comunemente diagnosticati escluso il NMSC 1, stime mondiali nel NMSC = Non Melanoma Skin Cancer 22

24 Nel 2002, l'incidenza del carcinoma polmonare tra la popolazione maschile italiana è risultata la più alta tra quelle di tutti i più comuni tumori, mentre tra le donne è stata solo quarta, preceduta dal carcinoma mammario, del colon retto e dell'utero [22] (Fig. 5). Queste incidenze sono in accordo con l'aspetto noto e globale che il carcinoma polmonare predilige i pazienti maschi, anche se nei Paesi occidentali da alcuni anni si sta assistendo ad un lento ma costante aumento della vulnerabilità femminile. Fig. 5: frequenza e mortalità dei tumori più comuni nella popolazione italiana al 2002 Per quel che riguarda la correlazione cancro-età, l intervallo di tempo statisticamente più 23

25 fragile risulta essere quello tra 55 e anni che, vista l'aspettativa di vita media nei Paesi sviluppati di 75.8 anni, fa del cancro al polmone una malattia a considerevole impatto sociale ed economico. Di nuovo e sempre per i Paesi tecnologicamente trainanti, da qualche anno si sta osservando un aumento del numero di pazienti afferenti alle fasce più giovani. Nonostante le numerose innovazioni sia sul piano diagnostico che su quello terapeutico che hanno portato ad un incremento della sopravvivenza e della qualità di vita dei pazienti, quello polmonare rimane il carcinoma con peggior prognosi su scala globale, in grado di rendere conto del 18% di tutti i decessi imputati al cancro (Fig. 6). In questo senso non c'è disaccordo con le ultime statistiche europee che imputano al tumore polmonare il 19.7% dei morti per cancro. Per l'esito tipicamente infausto della malattia è certamente determinante il fatto che molti carcinomi polmonari vengono diagnosticati in uno stadio già avanzato. Inoltre, molti pazienti sono fumatori abituali e perciò presentano ulteriori danni cardiaci e polmonari che pregiudicano l impiego delle più efficaci e adottate opzioni terapeutiche, quali la resezione chirurgica e le terapie multimodali. La più alta percentuale di sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi si riscontra tra i pazienti statunitensi (14%), mentre in Europa il valore è più basso (8%) ma comunque in accordo con la media caratteristica dei Paesi tecnologicamente sviluppati. 24

26 Fig.6 : mortalità dei più comuni tumori, stime mondiali al Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale La radioterapia è la tecnica più usata nei casi di carcinoma polmonare non resecabile chirurgicamente, grazie alla sua capacità di eradicare grosse e localizzate masse tumorali dalla regione toracica. Sebbene i primi impieghi nella pratica medica siano stati molto stimolanti, ben presto sono emersi i limiti di questa tecnica: una inaccettabile fallibilità a livello sistemico (stadi avanzati metastatizzati) e un povero controllo locale, di norma positivo solo nel 20-40% dei casi. Di fatto tutte le ricadute successive a cicli di radioterapia possono essere ricondotte o ad una non perfetta circoscrizione della sede del tumore primario o alla deposizione nella stessa di una dose 25

27 inadeguata, o a tutte e due le cause. D'altro canto, non si deve pensare che per migliorare il controllo locale si possa semplicemente aumentare la dose impartita al tumore; infatti questa via è fortemente limitata dai gravi effetti collaterali sui tessuti sani, come polmoniti ed esofagiti, la cui incidenza, come quella del controllo del tumore, aumenta proporzionalmente con l'aumento della dose totale assorbita. I futuri sviluppo nel campo della radioterapia devono quindi concentrarsi su due aspetti fondamentali: il deposito della dose più alta e geometricamente accurata possibile nella sede tumorale e la salvaguardia dei tessuti sani, in altre parole, la massimizzazione del rapporto di dosi tra regioni istologicamente normali e quelle interessate dalla malattia. Nella pratica, la radioterapia può venire somministrata mediante fasci di radiazioni di diversa natura: fotoni (tipicamente nella regione X) che rappresentano la pratica radiogena più tradizionale, particelle cariche leggere (elettroni) oppure pesanti (protoni o ioni di masse superiori, ad esempio ioni carbonio o ferro), come ancora particelle neutre (neutroni). Due aspetti sono di fondamentale importanza per capire i differenti benefici e/o svantaggi delle tecniche che impiegano le diverse radiazioni: la distribuzione di dose nei tessuti in funzione dello spessore attraversato e l'efficacia biologica, quantificata attraverso il parametro di Efficacia Biologica Relativa (RBE). 26

28 2.3 La BNCT nei tumori diffusi del polmone La selettività della BNCT, come già detto in precedenza, è determinata dalla microdistribuzione del 10 B, piuttosto che dalla conformazione del campo neutronico impiegato per il trattamento. Questo conferisce alla terapia una spiccata indipendenza dall anatomia del tumore e libera i terapisti dalla necessità di conoscere in dettaglio la conformazione della massa da trattare per progettare il più sicuro piano di irraggiamento. Questa proprietà della BNCT è ancora più rilevante quando si ha a che fare con una forma tumorale diffusa, il cui caso più eclatante è certamente quello della metastatizzazione secondaria. Il progetto WIDEST, finanziatio dall INFN e attivato presso l'università di Pavia, si inserisce in questo contesto ed ha come obiettivo lo studio della fattibilità della BNCT per il più largo spettro possibile di tumori maligni diffusi. Incoraggiati dagli esiti positivi dei trattamenti condotti sulle metastasi epatiche, nel 2005 è stato avviato un progetto di ricerca sui tumori diffusi del polmone. A livello mondiale il carcinoma al polmone è la più comune causa di morte di uomini e donne e il 14% del tasso di sopravvivenza a 5 anni è rimane immutato da anni. Per questa ragione è essenziale una nuova proposta e la validazione di una nuova terapia e nel 2005 è stato avviato il progetto WIDEST per iniziare uno studio sulla 27

29 fattibilità di una terapia mediante BNCT utilizzando l esperienza e le conoscenze dei gruppi che avevano già lavorato sulla ricerca del fegato. La filosofia alla base del trattamento del polmone è identica a quella adottata per il fegato, ma la realizzazione pratica richiede un cambiamento completo di prospettiva. Se nel fegato si poteva evitare completamente l'irraggiamento indesiderato di organi adiacenti facendo ricorso all'espianto, nel caso del polmone si preferisce non percorrere questa strada in quanto l'asportazione dell'organo implicherebbe dei pericoli maggiori per il paziente, principalmente legati al collasso che l'organo subirebbe immediatamente dopo l'estrazione dalla sede toracica. Per questo si preferisce effettuare l'irraggiamento dall'esterno dell'intera regione toracica. E possibile irraggiare il polmone con dei fasci di neutroni epitermici, che nell'attraversare i primi strati dei tessuti biologici subiscono la termalizzazione necessaria ad innescare le reazioni di cattura nella sede tumorale, oltre a garantire un deposito di dose decisamente più blando dei tessuti superficiali. Inoltre, la struttura spugnosa dell'organo e la bassa densità (tre volte inferiore a quella del fegato), implicano una minima attenuazione del campo neutronico, garantendo così degli ottimi livelli di omogeneità delle grandezze di campo. In verità, per via del diametro medio di un polmone umano, l optimum di omogeneità viene raggiunto prevedendo l'irraggiamento con due fasci contrapposti antero-posteriore e postero-anteriore. 28

30 L'attività del gruppo di ricerca di Pavia, dopo aver studiato con simulazioni Monte Carlo la distribuzione della dose in fantocci antropomorfi, ha concentrato i suoi sforzi nell'elaborazione di un modello animale con cui poter testare in vivo sia l'accumulo del drogante borato che l'irraggiamento neutronico. 2.4 Il modello animale Per ottenere campioni polmonari metastatici e tessuto polmonare normale abbiamo utilizzato ratti BDIX con metastasi polmonari indotte da cellule di colon adenocarcinoma [23]. Per indurre le metastasi negli animali è stata usata la linea cellulare DHD/K12/TRb di colon carcinoma. La linea cellulare è stata ottenuta da un colon adenocarcinoma indotto da 1,2 dimetilidrazina in ratti singenici BDIX, selezionata e clonata per la sua capacità di indurre tumori progressivi e metastatici nell ospite [24]. Le cellule possono essere mantenute a confluenza per molto tempo senza apparenti cambiamenti nella biologia cellulare, compresa la tumorigenicità. La linea cellulare cresce a confluenza cellule poligonali monostratificate in fiaschette per tessuto di coltura in Ham's F10 medium con aggiunta di 10% siero fetale di vitello. In una prima fase le metastasi erano indotte in ratti 29

31 BDIX (maschi, peso 250 g) con iniezione intrasplenica di 1.5 x 10 5 cellule di colon-carcinoma in anestesia generale. Dopo l iniezione veniva effettuata la splenoctomia. In questo modo l intervallo di tempo tra l iniezione cellulare e la comparsa delle metastasi tumorali del polmone era troppo lunga: giorni. Inoltre in alcuni animali le metastasi intaccavano solo il fegato mentre i polmoni rimanevano sani. Fig.7.: Immagine del torace di un ratto 10 giorni dopo l iniezione di cellule D/K12/Trb.Lo spread metastatico è visibile su tutta la superficie polmonare e in entrambi i polmoni. Per ottenere un modello più efficiente è stata utilizzata una tecnica chirurgica per indurre il tumore. Le cellule tumorali sono state iniettate via vena cava inferiore, con la stessa dose di 1.5 x 10 5 cellule. Tutti i ratti 30

32 sottoposti a questo trattamento hanno dato risultati positivi: giorni dopo i polmoni presentavano delle visibili metastasi macroscopiche (Fig.7). 2.5 Misura della concentrazione di 10 B nel polmone di ratto Per la misura della concentrazione del boro è stato utilizzato il modello animale descritto nel paragrafo precedente. La metodologia di induzione delle metastasi polmonari ci ha permesso di somministrare il BPA dopo10 giorni dall iniezione di cellule tumorali. La soluzione di BPA 0.14 M è stata preparata combinando BPA ( 10 B enriched, L-isomer) con un eccesso di fruttosio 10% molare in acqua. Il ph è stato portato a con NaOH, e dopo pochi minuti il ph è stato riportato a7.4 con HCl [25]. Sono stati studiati due metodi di infusione: intra-venosa e intra-peritoneale. Alcuni ratti sono stati usati per testare l efficacia di amministratione del metodo, ed è stata scelta la via intra-peritoneale perché era più facile da realizzare e con buoni risultati riguardanti i valori della concentrazione di boro. Sono stati trattati circa 50 ratti i cui risultati sono stati utilizzati per costruire la curva della farmacocinetica del BPA e per studiare la distribuzione spaziale del boro nel tessuto polmonare. I ratti sono stati sacrificati a intervalli regolari dopo l infusione della BPA; dopo il sacrificio 31

33 dei ratti gli organi sono stati congelati in azoto liquido e poi tagliati con un criostato Leyca allo spessore di 10 μm e colorati con ematossilina ed eosina. Le fettine di tessuto sono state organizzate in coppia o in triplette a seconda del tipo di analisi. Le fettina sono state tagliate e messe in coppia per l imaging del boro, e ciascuna di queste consisteva in un primo campione spesso 60 μm direttamente depositato su una pellicola sensibile per la autoradiografia neutronica, e un secondo spesso 10 μm depositato su un vetro per l analisi morfologica utilizzando il metodo do colorazione standard di ematossilina-eosina. Per l analisi quantitativa una fettina spessa 60 μm è stata depositata su un dischetto di mylar per essere irraggiato nella Colonna Termica del reattore, una seconda fettina è stata preparata per l analisi morfologica, e una terza fettina di nuovo spessa 60 μm è stata depositata su una pellicola per la neutronigrafia. Le tecniche perfezionate dal gruppo di Pavia riguardano l'imaging della distribuzione del 10 B (autoradiografia neutronica) e la sua quantificazione nei campioni di tessuto prelevati dal ratto (spettrometria α). La neutronigrafia consente di ottenere immagini della biodistribuzione di 10 B in scala di grigi. L'immagine risulta dallo sviluppo in soluzione di NaOH di una pellicola di nitrato di cellulosa (CN85, LR115) o di policarbonato (CR39) che ha la proprietà di essere sensibile alle particelle ad alto LET ma trasparente alla luce e ai raggi γ. Lo sviluppo mette in evidenza le tracce 32

34 lasciate dalle particelle α prodotte nella reazione di cattura sul 10 B. Infatti, per ottenere una neutronigrafia è necessario irraggiare con neutroni un campione di tessuto previamente depositato sulla pellicola. La valenza della neutronigrafia per la quantificazione delle concentrazioni di 10 B nei tessuti è doppia. Innanzitutto la radiografia mette in evidenza per semplice confronto l'accumulo selettivo del boro da parte del tessuto tumorale. Come detto, l'immagine radiografica si presenta come una scala di grigi, in cui le zone più scure derivano da un flusso elevato della radiazione ad alto LET e sono quindi in corrispondenza di regioni tissutali in cui l accumulo del 10 B è stato considerevole. Confrontando la radiografia con il relativo esame istologico è evidente la corrispondenza tra le zone scure della prima e quelle riconosciute come cancerose della seconda.(fig.8) Fig 8: confronto tra l esame istologico (sinistra) e l autoradiografia neutronica (destra) di due sezioni successive di tessuto polmonare (40 μm tra le due) 33

35 In secondo luogo, la neutronigrafia può essere impiegata per stimare quantitativamente le concentrazioni di drogante riscontrate nei campioni. In tal caso, i tempi di irraggiamento e sviluppo devono essere stabiliti in funzione della qualità delle tracce indotte dalle particelle, che devono essere ben separate per consentirne il conteggio. A questo punto, si stima la concentrazione di boro acquisendo in modo digitale le immagini e analizzandole con un opportuno software. Un ulteriore impiego della neutronigrafia è quello di strumento ausiliario alle tecniche analitiche propriamente quantitative, volte anche loro alla determinazione delle concentrazioni di 10 B. Tutte queste tecniche soffrono del problema del campione misto, ossia del fatto che un campione di tessuto malato non presenta mai una composizione omogenea, ma necessariamente alterna regioni di parenchima sano ad altre occupate dalle metastatasi. Inoltre, entro la medesima regione tumorale l'istologia e la relativa funzionalità cambiano profondamente, passando, ad esempio, da cellule proliferanti a nuclei di necrosi. In questi casi, la concentrazione di 10 B risultante dalle analisi è da intendersi come un valore medio. Questa stima è spesso molto lontana dal valore vero relativo tanto al parenchima sano quanto al tumore. Pertanto, per separare i contributi dei due tipi tissutali si deve conoscere la frazione di volume totale occupata dal tumore e dal tessuto sano. Per ottenere questi pesi si analizza in modo digitale l'immagine istologica, aiutandosi con la 34

36 corrispondente neutronigrafia per meglio selezionare le aree interessate dal tumore. L'altra tecnica impiegata a Pavia per misurare i livelli di boro nei tessuti dei campioni polmonari è la spettrometria α. In questo caso, si determinano le concentrazioni a partire dallo spettro energetico delle particelle cariche emesse nella reazione di cattura (n,α) sul 10 B. Si deve dunque irraggiare una fettina di tessuto polmonare all'interno della colonna termica e raccogliere le particelle cariche grazie ad un opportuno rivelatore posto di fronte al campione (rivelatore a Si). La descrizione di questa tecnica non è oggetto di questa tesi. 2.6 Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello animale Lo studio di farmacocinetica, condotto a Pavia ha coinvolto ad oggi una popolazione complessiva di 50 ratti, senza tener conto del gruppo di controllo che non è stato sottoposto ad alcun tipo di trattamento e da cui si è potuto studiare il background naturale di 10 B dei tessuti. Da questi controlli si è ottenuta una concentrazione di fondo inferiore a 0.5 ppm, compatibile con l'analogo risultato ottenuto nella ricerca sul fegato. Questo primo studio sul modello animale ha chiarito l'andamento temporale dei tassi di 10 B nei tessuti sano e tumorale, oltre al rapporto relativo tra i due che rappresenta la 35

37 discriminante per la fattibilità della BNCT per il polmone. In particolare, le misure di concentrazione sono state effettuate sacrificando gli animali dopo 1, 2, 4, 6 e 8 ore dall'infusione del BPA.(Fig.9) Fig 9: concentrazioni di 10 B nelle metastasi e nel tessuto polmonare sano e relativo rapporto in funzione del tempo trascorso dalla somministrazione del BPA. Dal secondo grafico riportato in figura 9, si può osservare come il rapporto R(t) = CT(t) / CH(t) sia massimo e pari circa a 4.5 dopo 4 ore dall'infusione del drogante (CT(t): concentrazione di 10 B nel tumore all'istante t, CH(t): concentrazione di 10 B nel parenchima sano all'istante t). Osserviamo in conclusione che è in corso un ampliamento della statistica relativa a questi valori, mediante il trattamento di altri ratti. 36

38 CAPITOLO 3 Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di ratto In questo capitolo viene descritta la parte sperimentale della tesi. Il lavoro è consistito nella realizzazione di un test in vivo-vitro di efficacia del trattamento BNCT del tumore metastatico polmonare usando cellule DHD/K12/TRb trattate con BNCT e inoculate in ratti BDIX. I risultati di questo lavoro saranno utili in seguito per testare meglio l efficacia della BNCT in questo tipo di trattamento costruendo una curva di sopravvivenza di ratti BDIX; dopo l induzione delle metastasi polmonari i ratti sarebbero sottoposti al trattamento BNCT completo (infusione di una soluzione di BPA e irraggiamento presso il reattore Triga Mark II in modo da esporre la zona toracica ad un flusso neutronico adeguato) e poi sarebbe costruita la curva di sopravvivenza. Cellule DHD/K12/TRb sono state incubate in medium contenente BPA e in seguito irraggiate in vitro ad una prestabilita dose neutronica. Dopo l irraggiamento le cellule sono state inoculate in ratti BDIX per valutare la loro capacità di indurre metastasi polmonari. Sono stati studiati tre gruppi di 37

39 ratti: un gruppo A a cui sono state inoculate cellule preventivamente sottoposte a trattamento BNCT in vitro (irraggiamento neutronico di cellule contenenti boro), un gruppo B in cui sono state inoculate cellule sottoposte ad irraggiamento neutronico in vitro in assenza di boro; e un gruppo di controllo C in cui sono state inoculate cellule non sottoposte ad alcun trattamento. Dopo ogni irraggiamento una quota delle cellule è stata utilizzata per valutarne la sopravvivenza attraverso il test di piastramento. 3.1 Trattamento BNCT in vitro La linea cellulare utilizzata, come già specificato, è la DHD/K12/TRb selezionata e clonata per la sua capacità di indurre tumori progressivi e metastatici in animali singenici [26]. Le cellule sono state fatte crescere in mezzo di coltura HAM F10 (50:50 v/v) arricchito con il 10% di siero fetale di vitello (FBS), una piccola quantità di glucosio DMEM e l 1% di gentamicina come protezione batterica. Per sottooporre le cellule a trtattamento BNCT queste sono state incubate per 4 ore in un mezzo di coltura con aggiunta di BPA ( 10 B al 95%) ad una concentrazione di 80μg/ml; prima dell irraggiamento neutronico sono state sciacquate in PBS per rimuovere ogni traccia di BPA non assorbito. La solubilizzazione della BPA avviene in fruttosio 6M (2ml); il ph viene portato al valore di 7.5 aggiungendo NaOH ed eventualmente HCL. Le cellule vengono poi sottoposte ad irraggiamento con neutroni termici nel reattore TRIGA Mark 38

40 II dell Università di Pavia alla potenza di 250 KW per 10 minuti. Il flusso neutronico termico nella posizione di irraggiamento era di cm -2 s -1. Le cellule irradiate senza arricchimento di Boro sono state prese come controllo Efficienza di piastramento Una cellula che sopravvive ad un trattamento con radiazione è quella che mantiene una capacità proliferativa illimitata, mentre quella che fallisce i propri tentativi di proliferazione è ritenuta annientata, nonostante essa possa dividersi o possa rimanere intatta nella popolazione cellulare. Il bilancio della sopravvivenza delle cellule dopo l irraggiamento viene fatto verificando la loro capacità di produrre un largo numero di progenie, cioè di produrre una colonia. Una delle più comuni procedure per testare la sopravvivenza cellulare è il saggio di piastramento in vitro. Le cellule vengono incubate in un medium appropriato a 37 C. L attaccamento delle cellule sulla superficie delle piastre tessutali e quelle che mantengono la capacità proliferativa crescono formando discrete colonie di cellule. Dopo un certo numero di giorni di incubazione, che dipendono dal tasso di crescita della cellula, i piatti sono prelevati dall incubatore e le colonie sono fissate e colorate in modo da essere facilmente contate. (fig. 10). 39

41 Fig.10. Test di efficienza di piastramento. Capsule Petri seminate con 100 cellule della linea di colon carcinoma DHD/K12/TRb, fissate e colorate con blu di Toluidina dopo 8 giorni di coltura. Esempi di cellule di controllo (n=68, A) e di cellule trattate con boro e irraggiate con neutroni, le quali hanno ricevuto una dose di 0.5 Gy (n=30, B) e che hanno quindi una sopravvivenza di 30/68 = 44%. Le cellule che non mantengono la capacità proliferativa in seguito all irradiazione possono ancora dividersi poche volte, ma formano solo delle minuscole colonie abortive. Se una colonia contiene più di 50 cellule (cioè deriva da una singola cellula da almeno sei cicli di divisione) è di solito in grado di avere una crescita continua e si può ritenere che derivi da una cellula sopravvissuta. L efficienza di piastramento (PE) di una popolazione cellulare è calcolata dividendo il numero delle colonie formate per il numero delle cellule piastrate. Con questa tecnica può essere costruita una curva della sopravvivenza cellulare in funzione della dose assorbita in 40

42 seguito agli irraggiamenti; si può così studiare l efficacia della BNCT su questo tipo di cellule [27] Sopravvivenza delle cellule post irraggiate Le cellule dopo essere state incubate per 4 ore in terreno di coltura arricchito con 80 ppm di 10 B sono state irraggiate in un campo di neutroni termici per 10 minuti a 250 kw; la dose di radiazioni assorbita dalle cellule è di 34Gy. Le cellule irraggiate e quelle non irraggiate, utilizzate come controllo, con e senza arricchimento di Boro, sono state piastrate in 5 Petri ripetute per ciascuna concentrazione selezionata con vaschette con un range che va da 1 x 10 6 a 5 x 10 6 cellule irraggiate con l arricchimento di Boro e da 50 a 250 in tutte le altre rimanenti condizioni studiate. Abbiamo ottenuto un PE di 0.05± 0.01% (SD) di cellule arricchite con boro e irraggiate, contro il PE di 94.4 ± 1% di cellule arricchite con il boro e non irraggiate, e un PE di 3 ± 0,5% per cellule irraggiate ma senza boro. 3.3 Studi in vivo Una parte delle cellule irraggiate come descritto nel paragrafo precedente è stata usata per verificare la loro capacità di proliferazione una volta 41

43 inoculate nel ratto attraverso la vena cava inferiore. Una popolazione di 30 ratti è stata suddivisa in 3 gruppi da 10; al primo gruppo (A) sono state inoculate 1.5 milioni di cellule DHD/K12/TRb dopo essere state trattate in terreno di coltura con BPA ed esposte ai neutroni come detto sopra; al secondo gruppo (B) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule sottoposto allo stesso irraggiamento delle precedenti ma senza esposizione al 10 B; al terzo gruppo (C) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule che però non avevano subito alcun trattamento (controllo). Ad intervalli di 1 mese dall'inoculo delle cellule, un animale per ogni gruppo veniva sacrificato; gli animali che morivano prima della data prefissata venivano sottoposti ad autopsia e il polmone era analizzato come negli altri casi. Una volta sacrificato l animale, il polmone veniva prelevato e conservato in formalina al 10%. Dopo fissazione in paraffina dai campioni di polmone venivano ricavate fettine di tessuto depositate su vetrino, trattate con eosinaematossilina e analizzate al microscopio ottico. La metodica di colorazione ematossilina-eosina prevedeva: 1) 15 minuti in Ematossilina 2) 20 minuti in acqua di fonte corrente 3) passaggio in acqua distillata 4) 40 secondi in Eosina 42